Способ получения гаплоидных растений-регенерантов из репродуктивных органов brassica oleracea l. in vitro. Растение регенерант

Способ адаптации растений-регенерантов земляники

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой. Изобретение позволяет успешно акклиматизировать землянику крупноплодную благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации кремнийсодержащим механокомпозитом на основе рисовой шелухи и зеленого чая. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к садоводству и питомниководству, и может быть использовано для подготовки растений-регенерантов земляники, выращенных в условиях in vitro, для адаптации к условиям ex vitro.

Известно, что одной из наиболее распространенных культур в садоводстве является земляника крупноплодная, также называемая ананасной или садовой (Fragaria х ananassa Duch.), а использование клонального микроразмножения этого растения позволяет получить не только оздоровленный посадочный материал, но и значительно ускорить процесс коммерческого размножения сортов земляники крупноплодной. Условия культивирования in vitro характеризуются постоянной высокой влажностью воздуха (достигающей 100%), пониженной освещенностью и гетеротрофным типом питания. Поэтому период адаптации ex vitro является стрессовым этапом для микрорастений, поскольку им необходимо приспосабливаться к обычным условиям среды, в которых на успешность адаптации растений влияют оптимальные параметры развития надземной части и корневой системы. Для успешного прохождения этого стрессового этапа необходим поиск новых регуляторов роста и развития, обеспечивающих быструю и эффективную приживаемость посадочного материала.

Известно, что на этапе адаптации микрорастения подкармливают раствором минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга (1. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др.; под ред. В.С. Шевелухи. - 3-е изд., перераб и доп.- М.: Высш. шк., 2008. - С. 154-155). Данный раствор отличается хорошо сбалансированным составом питательных веществ, однако в нем не учтена необходимость балансировки по необходимому элементу - кремнию.

Согласно современным представлениям питание организмов должно быть сбалансировано по кремнию, и для этой цели разработан механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая, содержащий в качестве источника кремния водорастворимый и биодоступный аморфный диоксид кремния (2. Пат. РФ №2438344, кл. А23K 1/00, А23K 1/16, опубл. 10.01.2012 г.). Продукт - кормовую муку, полученную механохимической обработкой в мельницах-активаторах по указанному патенту (2), будем в дальнейшем для краткости называть механокомпозитом. Данный механокомпозит содержит водорастворимые соединения кремния (в пересчете на кремний) в количестве 9-12 мкг/мл в испытуемой суспензии при испытании качества механокомпозита согласно (2).

Смысл термина «механокомпозит» заключается в подчеркивании фундаментальных отличий в строении и свойствах порошковых материалов - смешанных систем, сформированных при обработке в специальных мельницах-активаторах. Отличительным признаком механокомпозита является наличие развитой, с особыми свойствами, поверхности раздела фаз растительного сырья и реагента и связанная с данным эффектом повышенная реакционная способность (3. Механокомпозиты - прекурсоры для создания материалов с новыми свойствами / [А.И. Анчаров и др.]; отв. ред. О.И. Ломовский; Рос. акад. наук, Сиб. отд-ние, Ин-т химии твердого тела и механохимии [и др.]. -Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2010. - (Интеграционные проекты СО РАН; вып. 26). - С. 5).

Однако указанный механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая был испытан на животных, но не был испытан для подкормки микрорастений земляники крупноплодной. Кроме того, не очевидно, что данный механокомпозит способен дать положительный эффект именно для микрорастений земляники крупноплодной и именно на стадии адаптации как в силу нетрадиционных состава и способа получения композита (состав: целлюлоза и гемицеллюлоза, водорастворимый кремний, катехины зеленого чая; способ получения: механохимический), так и в силу сложности стадии адаптации и множества факторов (температура, влажность, освещенность) и явлений, имеющих значение (например, нарушается или не нарушается деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит или не происходит потеря большого количества воды и гибель растений; стимулирует или нет механокомпозит рост надземной части растений-регенерантов; стимулирует или нет механокомпозит состояние корневой системы растений-регенерантов; зависит или не зависит результат от генотипа, т.е. сорта земляники крупноплодной). Т.о. без доказательств - результатов специальных исследований - положительный эффект применения данного механокомпозита для целей настоящего изобретения не очевиден для специалистов. Эти доказательства - результаты специальных исследований - приводятся в настоящем изобретении ниже.

Известен «Способ получения посадочного материала земляники в культуре ткани» (4. Пат. РФ №2007072, кл. А01Н/00, опубл. 15.02.1994 г.), согласно которому при микроклональном размножении земляники укоренение и адаптацию побегов осуществляют одновременно в культивационных сосудах, которые перед покрытием термоусадочной пленкой дополнительно закрывают пробками, выполненными из автоклавированного перлита.

Недостатком известного технического решения, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на стадии адаптации для подкормки микрорастений не был применен кремнийсодержащий препарат, причем сама стадия адаптации не была выделена, так как укоренение и адаптация побегов осуществлялись одновременно в культивационных сосудах; вследствие этого общая приживаемость растений оказалась невелика (87% в полевых условиях, в теплицах - 75-80 %).

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является «Способ подготовки растений земляники садовой (Fragaria L.), размноженных in vitro, к условиям культивирования ex vitro» (5. Пат. РФ №2302106, кл. А01Н/00, опубл. 10.07.2007 г.), который включает подготовку растений in vitro, то есть этап адаптации со специально подобранными условиями: растения выдерживают в темноте, при температуре от 1 до 10°С, на агаризованной питательной среде с 4-10% сахарозы в течение 20-60 дней, после чего переносят в почвенный субстрат.

В известном техническом решении укоренение и адаптацию побегов осуществляют не одновременно, а последовательно, то есть выделяют стадию адаптации (так что приживаемость высаженных в почву растений становится не ниже 95%), однако недостатком известного технического решения, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на стадии адаптации для подкормки микрорастений не был применен кремнийсодержащий препарат (обеспечивающий приживаемость не ниже 99%).

Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в улучшении адаптации растений-регенерантов земляники садовой благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации кремнийсодержащим препаратом.

Поставленная задача решается благодаря заявляемому способу адаптации растений-регенерантов земляники, включающему этап адаптации, в котором растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

Положительное влияние кремния на рост надземных органов растений можно объяснить усилением фосфорилирования сахаров, что в свою очередь увеличивает поступление энергии для метаболических процессов и синтеза сахаров (6. Adams F. Interaction of phosphorus with other elements in soil and in plants // Proc. Symp. The Role of Phosphorus in Agriculture. Am. Soc. Agron., Madison, WI, 1980. - P. 655). Положительное влияние кремния на развитие корневой системы растений можно объяснить тем, что дефицит кремния служит одним из лимитирующих факторов развития корневой системы растений (7. Колесников М.П. Формы кремния в растениях // Успехи биологической химии, 2001. - Т. 41. - С. 301-332; 8. Savant N.K., Snyder G.H., Datnoff L.E. Silicon management and sustainable rice production //Adv. Agron., 1997. - V. 58. - P. 158-199).

Заявляемый способ и исследования его результатов осуществляли на базе лаборатории биотехнологии ЦСБС СО РАН (г.Новосибирск). Объектом служили растения-регенеранты Fragaria х ananassa Duch. из коллекции ЦСБС СО РАН, полученные методом клонального микроразмножения в возрасте четырех месяцев. Использовались следующие сорта и гибриды: «Солнечная полянка», «Царица», «Улыбка июня», гибрид «5-90-21», «Боровицкая» и «Фестивальная». Выбор данных сортов обусловлен перспективностью их использования в условиях Западной Сибири благодаря повышенной устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды.

Механокомпозит на основе рисовой шелухи и зеленого чая был изготовлен в ИХТТМ СО РАН согласно (2).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statistica для Windows, версии 6.1 программного обеспечения StatSoft, Inc. Экспериментальные данные были проверены на соответствие нормальному распределению. Для каждого показателя были рассчитаны средние значения и стандартные ошибки среднего. Так как полученные результаты не подчинялись нормальному распределению, для выявления достоверных различий между параметрами в контрольном и опытном вариантах использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при достигнутом уровне значимости р≤0,05.

Осуществление заявляемого способа показано в примерах.

Пример 1 (контроль: без механокомпозита)

При выращивании растений в условиях in vitro применяли стандартные методики культивирования. Использовали среды по прописи Мурасиге и Скуга с рН=5,6-5,8. Культивирование проводили в условиях 16-часового фотопериода, при температуре 23-24°С и освещенности 3-4 клк. Мультипликацию побегов осуществляли методом активации пазушных меристем ростовых побегов. В качестве индуктора побегообразования использовали цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрациях 0,25-2,0 мг/л. Субкультивирование проводили через 25-30 суток. Микрорастения укореняли на агаризованной безгормональной питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макро- и микроэлементов и пониженным содержанием сахарозы (15 г/л). Для опытов отбирали регенеранты с высотой розетки 3,5-5,0 см, с 5-7 сформированными листьями, 2-6 корнями и корневой системой около 1,5-2,0 см. Растения вынимали из культуральных сосудов, отмывали корни от агара в дистиллированной воде, а затем помещали в вегетационные кассеты со стерильным кварцевым песком объемом 50 мл. Контрольную группу растений увлажняли водным раствором, содержащим

На заключительном этапе адаптации растения извлекали из стерильного песка и пересаживали в стаканы с почвенным субстратом объемом 150 мл, состоящим из смеси торфа с перлитом, перегноя и песка в соотношении 1:1:0,5, не допуская засыпания верхушечной почки землей. Адаптацию осуществляли в условиях теплицы при 16-часовом фотопериоде, температуре 23-25°С, освещенности 15 клк и влажности воздуха 60-70%. Высаженные растения опрыскивали и регулярно поливали.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 2 (опыт: с механокомпозитом)

Заявляемый способ осуществляли по примеру 1 с единственным отличием: растения увлажняли не водным раствором, содержащим концентрации стандартных компонентов среды по прописи Мурасиге и Скуга, а водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая (концентрация 3 г/л). Суспензию механокомпозита для полива готовили свежую, механокомпозит перемешивали с водой комнатной температуры, настаивали 1 час при комнатной температуре, не фильтровали, при поливе постоянно перемешивали.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Примечания: 1 - Обработка водным раствором 1/4 концентрации среды по прописи Мурасиге и Скуга.

2- Обработка водной суспензией механокомпозита, 3 г/л.

3 - Наличие достоверных различий по U-критерию (при р≤0,05).

4 - Среднее значение показателя ± стандартная ошибка среднего.

Результаты исследований показали, что через 4 недели культивирования земляники крупноплодной в кассетах при поливе водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая все изучаемые сорта продемонстрировали достаточно высокую приживаемость растений-регенерантов (99,0-100%) по сравнению с контрольными вариантами (86,8-100%). При использовании данного препарата выявлено повышение приживаемости растений у сортов «Царица», «Фестивальная» и «Улыбка июня» на 13,2%, 8,3% и 5,9% соответственно (табл. 1).

Успех адаптивности регенерантов в значительной степени определяется биометрическими показателями ростовых параметров растений. В настоящем эксперименте растения отличались хорошо сформированной розеткой листьев в обоих вариантах. При этом морфометрические показатели количества листьев изучаемых образцов, кроме сорта «Улыбка июня», не имели достоверно значимых отличий. В то же время обнаружено стимулирующее влияние механокомпозита на рост надземной части растений-регенерантов. Прирост высоты розетки почти у всех исследованных сортов, обработанных водной суспензией механокомпозита, достоверно превысил контрольный вариант. В зависимости от генотипа высота розетки увеличилась относительно контроля в 1,3-4,1 раза, кроме сорта «Улыбка июня». Возможно, это отклонение от общей тенденции роста надземной части у данного сорта связано с его генетическими особенностями.

В настоящем эксперименте также показано положительное влияние обработки водной суспензией механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая на рост корневой системы растений-регенерантов (табл. 1). Почти у всех исследованных сортов, обработанных водной суспензией механокомпозита, наблюдался более интенсивный прирост корней по сравнению с контрольными вариантами. Длина корневой системы достоверно увеличилась в 1,1-2,0 раза в зависимости от генотипа. У сорта «Царица» увеличение этого показателя оказалось недостоверным, хотя тенденция к увеличению длины корневой системы также наблюдалась. Регенеранты сортов «Боровицкая», «Солнечная полянка» и гибрида «5-90-21», обработанные водной суспензией механокомпозита, сформировали достоверно большее число корней по сравнению с контрольными вариантами. Количество корней увеличилось в 1,3-1,8 раза соответственно по сравнению с контрольной группой.

Для всех сортов зафиксировано достоверное увеличение биометрических показателей хотя бы по одному из ростовых параметров растений (табл. 1).

После адаптации в песке растения переносили в контейнеры с субстратом, состоящим из смеси торфа с перлитом, перегноя и песка (1:1:0,5), а через 4 недели в стаканы с той же смесью. Приживаемость на данном этапе составила 99,9%. Через 6 недель рассада соответствовала требованиям, предъявляемым к посадочному материалу земляники крупноплодной с закрытой корневой системой (9. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 53135-2008. Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия).

Достигаемый технический результат заявляемого технического решения заключается в улучшении адаптации земляники крупноплодной, выражающемся в улучшении роста и приживаемости растений-регенерантов F. ananassa в условиях ex vitro (до уровня не ниже 99%), благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая.

Использование изобретения позволит микрорастениям земляники крупноплодной с помощью механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая успешно пройти стрессовый этап - период адаптации ex vitro - и тем самым обеспечить быструю и эффективную приживаемость посадочного материала земляники крупноплодной.

Общественно-полезный эффект использования изобретения заключается в обеспечении населения плодами земляники крупноплодной.

Дополнительным положительным эффектом, достигаемым изобретением, является возможность развития химической промышленности в русле идеологии «зеленой» химии, требующей существенного увеличения доли возобновляемого сырья в химической промышленности, а это можно осуществить, в частности, за счет новых разработок в области переработки возобновляемого растительного сырья, таких как технология производства кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая.

Способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, отличающийся тем, что растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

www.findpatent.ru

Способ получения растений - регенерантов in vitro

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению регенератов in vitro. Развитие методов биотехнологии, в основе которых лежит выращивание изолированных органов, тканей и клеток на искусственных питательных средах с последующей регенерацией целых растений, определяет все большее внедрение их в практику сельского хозяйства. Они способны значительно ускорить селекционный процесс и значительно расширить границы воздействия человека на живую природу. При разработке методов in vitro, где требуется получение регенерантов для внедрения в процесс селекции, имеют дело с возникновением меристематических зон из каллуса и формированием из последних растений. Эта методика необходима, в первую очередь, при микроклонировании растений, а также для получения сомаклональной вариабельности и при работе на селективных средах, включающих в себя какой-либо селективный фактор (соль, гербициды, токсины фитопатогенных грибов и пр.). В литературе имеются исследования, посвященные разработке способов формирования регенерантов зерновых, в частности пшеницы из каллусной ткани зародыша [1-2] . При использовании этих способов зародыши вычленяют из незрелых зерновок и высаживают на питательную среду для инициации каллуса. Культивирование посаженных зародышей осуществляют в темноте при t = 26оС. Материал просматривают каждые 2-3 дн. с тем, чтобы удалить основной проросток в случае его роста и тем самым способствовать формированию каллуса на поверхности щитка. Визуально формирование каллуса отмечается на 6-10 д., однако рост основного проростка тормозит этот процесс и его приходится обламывать по крайней мере 2 раза, что очень осложняет работу. Нарастание каллуса на щитке может происходить в течение 1-3 нед. и больше. За это время на каллусах оформляются видимые плотные очаги, отличающиеся от рыхлого оводненного каллуса по консистенции и цвету. Каллус с плотными участками оказывается морфогенным и при пересадке его или только одних плотных участков на среду для регенерации формируются сначала зеленые листообразные структуры, а спустя: 2-3 нед. проростки. Следует отметить, что с началом морфогенетического процесса плотный участок, представляющий собой кластер эмбриональных клеток, легко разделяется на отдельности (эмбриоиды), каждая из которых дает проросток, также отсаживаемый отдельно. От посадки экспланта на питательные среды и до выхода растений - регенерантов работа проходит в три этапа: 1. - индукция каллуса и заложение меристематических зон; 2. - формирование регенерантов; 3. - подращивание растений и ускорение их перед высадкой в грунт. На каждом из этих этапов среды отличаются заменой одних добавок на другие, их количеством и соотношением. Такая замена позволяет направлять процесс или в сторону каллусообразования или органогенеза с развитием корней или регенерантов. В процессе разработки оптимальной среды для получения регенерантов из каллуса пшеницы выбрана универсальная среда Мурасиге и Скуга, выпускаемая промышленностью в готовом виде, которая включает в себя следующие компоненты, мг/л : макросоли: Nh5NO3 1650; KNO3 1900; MgSO4˙7h3O 370; CaCl2 ˙ 2h3O 440; Kh3PO4 170; микросоли: MnSO4 ˙h3O 22,3; h4BO3 6,2; ZnSO4˙7 h3O 8,6; CoCl2˙6 h3O 0,025; CuSO4˙5 h3O 0,025, NaMoO4˙2 h3O 0,25; KI 0,83; витамины: тиамин 0,1-10,0; миноинозитол 80-100; пиридоксин 0,5-1,0; никотиновая кислота 0,5-1,0. Исходя из этапов работы по получению растений - регенерантов на указанной среде для каждого этапа предназначаются следующие добавки при культивировании зерновых, в частности пшеницы, мг/л:Среда I (для индукции каллуса и формирования меристематических зон). Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 20000-30000, мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л. Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 1,5-2,5 мг/л. Среда II (для формирования регенерантов). Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 10000-15000 мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л, α -нафтилуксусная кислота (АНУ) и кинетин по 0,5-1,0 мг/л. Среда III (для подращивания растений и укоренения их). Среда Мурасиге и Скуга, сахароза 10000-15000 мг/л, агар-агар 6000-7000 мг/л. Добавок нет. При посадке незрелых зародышей зерновых, в частности пшеницы, имеет место массовая регенерация растений. И тем не менее число растений - регенерантов сильно колеблется, в первую очередь, в зависимости от генотипа, но также и от состава культуральных сред. Целью изобретения является разработка способа получения регенерантов растений in vitro, дающего большее количество растений, особенно на селективных средах. Поставленная цель достигается с помощью способа получения регенерантов in vitro, включающего посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон, выращивание проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для оформления их в регенеранты, а также подращивание и ускорение растений до пересадки в грунт, отличительным признаком которого является то, что в среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000-20000 мг/л. Использование ацетона в питательных средах для получения регенерантов высших растений в научно-технической и патентной литературе не описано, что позволяет считать, что предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". Как известно, ацетон относится к группе кетоновых тел, которая включает ацетон, ацетоуксусную кислоту и β -оксимасляную кислоту. В организме ацетон распадается на СО2 и Н2О. Способ получения регенерантов in vitro на средах, содержащих ацетон, был апробирован на разных культурах, в том числе пшенице, луке, чесноке, капусте и рапсе. П р и м е р 1 (контроль). Незрелые зародыши пшеницы культивировались на питательной среде следующего состава, мг/л: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, сахароза 30000, агар-агар 7000; витамины: тиамин 10, миоинозитол 100, пиридоксин и никотиновая кислота по 1,0, 2,4-Д 2,5 (в среде для инициации каллуса или меристематических зон) или АНУ и кинетин по 1,0 (в среде для регенерации). рН 5,6-5,8. На среду I высаживают незрелые зародыши пшеницы щитком вверх в возрасте 10-14 д. после опыления по 20 пробирок каждого образца по 6 зародышей в каждой пробирке - всего 120 зародышей каждого образца. Через 1-2 д. после посадки начинает расти заложенный основной проросток, который следует обломать. Еще через 3-7 д. необходимо просмотреть пробирки и удалить продолжающие расти остатки основного побега. Через 7-10 д. после посадки на поверхности щитка отмечают образование каллуса и его последующее нарастание. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет 76-85% от числа посаженных зародышей. Каллусы находятся на этой среде 21-28 д. - до появления плотных участков - меристематических очагов, после чего плотные участки переносятся на среду II, на которой из них в течение 4-8 нед. образуются проростки в зависимости от генотипа в 25-30% случаев. Оставшийся после переноса каллус высаживают на среду I для дальнейшего нарастания каллуса и формирования в нем новых меристем. Возможно культивирование незрелых зародышей пшеницы на среде Мурасиге и Скуга следующего содержания, мг/л: сахароза 20000, агар-агар 60000, тиамин 1,0, миоинозитол 80, пиридоксин и никотиновая кислота по 0,5, 2,4-Д 1,5 (в среде для инициации каллуса и меристематических зон) или АНУ и кинетин по 0,6 (в среде для регенерации). рН = 5,6-5,8. На этих средах получены результаты, аналогичные вышеприведенным, с той разницей, что при уменьшении количества 2,4-Д с 2,5 до 1,5 мг/л происходит на 2-3 д. ускорение во времени заложения меристематических зон. Эты данные дают возможность сформулировать основную (базовую) среду I и II для дальнейшей работы, мг/л: среда Мурасиге и Скуга, агар-агар 6500, сахароза 30000, тиамин 10,0, миоинозитол 100, пиридоксин и никотиновая кислота по 0,5, 2,4-Д (в среде I) 2,0 или АНУ и кинетин (в среде II) 0,5 и кинетин 1,0. Полученные проростки переносились на среду III для подращивания и ускорения. Не отмечено разницы в подращивании и укоренении на средах, составленных по- максимуму или по- минимуму (сахароза 15000 мг/л, агар-агар 7000 мг/л или сахароза 10000 мг/л, агар-агар 6000 мг/л. Поэтому для подращивания и укоренения можно рекомендовать в качестве оптимального варианта среду Мурасиге и Скуга, содержащую сахарозу 12000 мг/л и агар-агар 6000 мг/л (базовая среда III). Хорошо развитые растения из пробирок были высажены в грунт, где они дали семена. Следует отметить нарушение в отдельных колосьях растений регенерантов (Ро) фертильности некоторых цветков, которое исчезало у растений первого поколения (Р1). П р и м е р 2 (опыт). Проводят культивирование незрелых зародышей пшеницы на среде с ацетоном следующего состава, мг/л: базовая среда I или II плюс ацетон 5000, 10000, 20000 и 50000. Незрелые зародыши тех же образцов пшеницы культивируют вышеописанным способом (пример 1) щитком вверх в возрасте 10-14 д. после опыления по 20 пробирок каждого варианта по 6 зародышей в каждой пробирке - всего 120 зародышей каждого образца. Просмотр посадок через 2-3 д. обнаружил, что рост основного проростка угнетен: проростки не переходят к росту вообще или растут слабо и в крайнем случае требуется однократное их обламывание, что значительно облегчает работу. В этом воздействии - первое значимое преимущество сред с ацетоном. Дальнейшее развитие каллуса идет интенсивно и через 12-15 д. в нем закладываются меристематические зоны, которые после переноса их на среду для регенерации во множестве формируют регенеранты. Число меристематических зон на среде с ацетоном составляет 87-95% по отношению к числу посаженных зародышей. На этой среде получено 53-65% регенерантов. Следует подчеркнуть высокую активность и непрерывность процесса закладки меристематических зон и связанное с этим увеличение числа регенерантов на среде с ацетоном по сравнению с контролем. Этот эффект является вторым значимым преимуществом сред с ацетоном для получения регенерантов пшениц из каллусной ткани in vitro. Апробировано культивирование незрелых зародышей на базовой среде с ацетоном 5000, 10000, 20000 и 50000 мг/л. Лучшими вариантами по выходу каллуса, меристематических зон и регенерантов следует считать варианты с содержанием ацетона 10000 и 20000 мг/л, при этом между этими вариантами не было принципиальной разницы. При содержании ацетона в среде 5000 мг/л наблюдался слабый эффект. Культивирование зародышей на среде с содержанием ацетона 50000 мг/л привело к гибели эксплантов, поэтому этот вариант не учитывается. Регенеранты, полученные на среде II, подращивались и укоренялись на базовой среде III и высаживались в грунт, где они давали семена. Следует подчеркнуть, что фертильность растений Ро в грунте в варианте 10000 и 20000 мг/л ацетона была в целом практически равна таковой в контроле, но у отдельных растений в колосьях было до 50% стерильных цветков. Как и в контроле, растения Р1 полностью восстанавливали фертильность. Кроме того, у растений Ро и Р1 отмечена высокая кустистость (10-30, стеблей), при этом основная часть побегов была продуктивной. В контроле кустистость была обычной для яровых пшениц - 2-5 побегов. В высокой кустистости опытных растений яровой пшеницы дающей возможность получить в Р1 больший урожай зерна с одного куста - третье преимущество сред с ацетоном для получения регенерантов пшениц из каллусной ткани in vitro. Пример 2 дает возможность рекомендовать среду с ацетоном для пшениц следующего составa: базовая среда плюс ацетон 15000 мг/л. Cледует отметить, что настоящие исследования прошли экспериментальную проверку в течение 3 лет, при этом получены однозначные результаты. В связи с крайне интересными данными способ был апробирован также на культуре in vitro лука при формировании регенерантов и получены аналогичные результаты. П р и м е р 3 (контроль). Проводят культивирование тканей донца луковиц лука с целью микроклонирования их для быстрого размножения новых сортов и ценных селекционных образцов, а также для вегетативного размножения гибридов F1-F2 (когда требуется сохранить их без расщепления) или стерильных межвидовых гибридов. Поскольку донце лука содержит меристематические клетки, для микроклонирования не требуется образования каллуса и закладки в нем меристематических зон, поэтому среда I упраздняется. Посадку экспланта производят на среду II (для регенерации), представленную базовой средой, содержащей вместо кинетина 2,5-3,5 мг/л бензиламинопурина (БАП). Для посадки луковицу освобождают от сухих чешуй, стерилизуют, отмывают стерильной водой, снимают первый ряд сочных чешуй и обрезают так, чтобы донце с остатками сочных чешуй (не более 0,5 см длиной) можно было разрезать на 5-6 участков (0,5 х 0,5 см). Каждый участок высаживается на питательную среду. Следует отметить, что экспланты, взятые с периферийных участков донца дают больше регенерантов, чем взятые из центральных участков. Культивирование проходит на свету при освещении 10-15 тыс.пкс, длине дня 16 ч и t = 20-25оС. Через 2-3 нед появляются первые регенеранты в виде тонких зеленых иголочек, которые по мере их появления освобождают от исходных чешуй и тканей и пересаживают или на среду II для нарастания новых регенерантов, или на среду III для подращивания и укоренения. Показано, что при культивировании эксплантов на среде II, содержащей 2,5 или 3,5 мг/л БАП нет принципиальной разницы с точки зрения выхода регенерантов. Поэтому рекомендуется оптимальная среда - базовая + БАП 3,0 мг/л. Показано, что от 1 экспланта на этой среде можно получить в течение 2,5-3,5 мес. 50-70 растений, причем работу по микроклонированию можно проводить в любое время года. П р и м е р 4 (опыт). Вышеописанным способом проводят культивирование тканей донца лука на базовой среде + БАП 3,0 мг/л + ацетон 10000-20000 мг/л. Не было принципиальной разницы в развитии регенерантов между вариантами 10000 и 20000 мг/л ацетона в среде. Поэтому следует считать оптимальной среду с ацетоном для микроклонирования лука, мг/л: базовая среда + БАП 3,0 + ацетон 20000. На этой среде количество регенерантов увеличилось в 3,5 раза, что составило, в зависимости от генотипа, за 2,5-3,5 мес. 150-300 регенерантов от одного экспланта. Аналогичные данные получены при микроклонировании чеснока. П р и м е р 5. Известно, что регенерация различных сортов и разновидностей капусты затруднена, что служит большим препятствием для работы in vitro и методами генной инженерии с этим объектом. Поэтому был произведен эксперимент по получению регенерантов на среде с ацетоном. Для этого семядоли проростков белокочанной капусты сортов Амагер и Июньская 10, а также капусты брокколи после стерилизации высаживали на агаризированную среду II, представленную базовой средой и содержащей вместо кинитина 2,5-3,5 мг/л БАП. Культивирование проходило на свету при освещении 10-15 тыс.лкс, длине дня 16 ч. и t = 20-25оС. Показано, что на указанных средах ни в одном случае посадки эксплантов не было регенерантов. Поэтому произвели высадку семядолей на среду II с содержанием БАП 3,0 мг/л и дополненную ацетоном 10000-30000 мг/л. На среде с ацетоном 20000 мг/л отмечено появление максимального количества регенерантов: у сорта Амагер число эксплантов с регенерантами составило 10% (в контроле 0%), у сорта Июньская 10 - 80% (в контроле 0%), у брокколи - 11% (в контроле 0%). При посадке эксплантов на среду с ацетоном 10000 мг/л регенерантов практически не было. При посадке на среды, содержащие 30000 мг/л, регенеранты были несколько изуродованными (со скрученными листьями). Таким образом следует считать оптимальной среду с ацетоном для получения регенерантов капусты из семядолей: базовая среда + БАП 3,0 мг/л + ацетон 20000 мг/л. При посадке гипокотиля проростков капусты на оптимальную среду с ацетоном у брокколи получено 44% эксплантов с регенерантами, в контроле - 13%. Аналогичные результаты получены и при посадке in vitro тканей рапса. Таким образом на основании приведенного материала можно сделать вывод, что введение ацетона в питательную среду имеет преимущество в технике получения регенерантов in vitro.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ IN VITRO, включающий посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон, получение проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для формирования регенерантов, подращивание и укоренение растений на питательной среде до высадки их в грунт, отличающийся тем, что в питательные среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000-20000 мг/л.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 27-2000

Извещение опубликовано: 27.09.2000        

bankpatentov.ru

Способ получения гаплоидных растений-регенерантов из репродуктивных органов brassica oleracea l. in vitro

Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro относится к области биотехнологии предназначен для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L. и может быть использован для получения нового исходного материала для создания сортов. Задача изобретения ускорить процесс селекции. Это достигается за счет того, что к питательной среде Мурасиге и Скуга в качестве индукторов эмбриогенеза добавляют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов капусты белокочанной, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

Изобретение относится к области биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L. и может быть использовано для получения нового исходного материала для создания сортов.

Известен ряд способов получения гаплоидов у растений: отдаленная гибридизация, внутривидовая гибридизация, выявление среди близнецов, при воздействии на пыльцу рядом физических и химических факторов, при межвидовых скрещиваниях с использованием генетических маркеров (Патент РФ №2175189, патент РФ №2035134, патент РФ №2084135, патент РФ №2142013).

Однако все данные методы позволяют получать гаплоидные растения в небольшом количестве (единицы и десятки). Получение гаплоидных растений возможно посредством андрогенеза и гиногенеза in vitro, гаплоиндуктора, партеногенеза (апомиксис), полиэмбрионии. Наиболее перспективным подходом к разработке технологии получения гаплоидных растений - это культивирование изолированных пыльников или завязей in vitro.

Работы по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica ведутся во многих странах. Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим работы по выявлению сортов, гибридов, линий, обладающих высокой гаплоидной способностью и установление факторов, оказывающих влияние на этот процесс, являются актуальными.

Известен способ получения гаплоидных растений капусты белокочанной, заключающийся в культивировании изолированных микроспор на безгормональной питательной среде Гамборга В5, содержащей 13% сахарозы. Для изолирования микроспор применяют метод центрифугирования фильтрата (Шмыкова Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур / Диссертация, Москва, 2006). Недостатком данного метода является трудоемкость технологии выделения микроспор из пыльников.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гаплоидных растений Brassica oleracea L, заключающийся в культивировании изолированных пыльников на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, сахарозу - 120 г/л (Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор / А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). - М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. - С. 306-307). Недостатком известного аналога является применение дорогостоящих гормонов (6-бензиламинопурин (БАП), α-нафтилуксусной кислоты (НУК)), а также получение растений-регенерантов из гетерогенной каллусной ткани, которая является источником сомаклональной вариабельности растений, а следовательно частота образования гаплоидных растений резко уменьшается.

Задача предполагаемого изобретения - ускорение процесса селекции за счет повышения ча стоты возникновения гаплоидных растений Brassica oleracea L in vitro, используемых в качестве нового исходного материала для создания сортов.

Поставленная задача достигается за счет того, что пыльники и завязи культивируют на безгормональной питательной среде по прописи МС, при этом в качестве индукторов эмбриогенеза добавляют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов Brassica oleracea L, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

Растительные экстракты получали из сырой биомассы образцов (от 200 до 350 мг), которые экстрагировали 100% растворителем DMSO, путем растирания ее в ступке. После этого полученную массу выдерживали в течении 1 часа при температуре 23°C, фильтровали через фильтровальную бумагу и затем стерилизовали путем пропускания их через бактериальный фильтр (Millipore, pore size 0,45 дМ). Полученный растительный экстракт добавляли в питательную среду в концентрации 1-1,5 мл/100 мл. Пыльники и завязи асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и культивировали на индуцирующих питательных средах МС в чашках Петри, которые помещали в климакамеру (Binder, Германия) и инкубировали в темноте при температуре 35°C в течение 5-ти суток, после чего температурный режим уменьшали до 25°C. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем переносили в световую комнату, где был установлен 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс.лк. При добавлении растительного экстракта в концентрациях меньше 1 мл/100 мл формирование эмбриоидов не происходило, а в концентрациях больше 1,5 мл/100 мл этот процесс был менее интенсивным. В дальнейшем сформированные эмбриоиды отделяли от первичного экспланта и переносили на среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, а также гормоны ИУК - 2 мг/л, БАП - 1 мг/л, сахарозу - 3%, агар - 7 г/л. В этих условиях формировались растения, которые проявили высокую способность к последующему размножению.

Предлагаемый способ получения растений-регенерантов сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической селекционной работе:

1. Технология предполагает применение доступного растворителя.

2. Отсутствие в использовании дорогих фитогормонов и регуляторов роста (дешевая технология).

3. Предлагаемый способ легок в исполнении по сравнению с ранее предложенными известными авторами.

Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения гаплоидных растений. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением растительных экстрактов, не достигался в известных решениях.

Использование изобретения позволит увеличить частоту возникновения гаплоидных растений в 2-3 раза, что дает возможность получать их в количестве, достаточном для ведения селекционных работ, что в значительной степени ускоряет процесс селекции. Так как в контрольном варианте данный показатель составляет в культуре пыльников и завязей 1,85% и 3,7% соответственно. В то время как, в предлагаемом способе учитываемый показатель составил 2.5% и 8,6% соответственно.

Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro, включающий культивирование пыльников и завязей на питательной среде Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что в качестве индукторов эмбриогенеза используют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов Brassica oleracea L, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

www.findpatent.ru

способ получения растений - регенерантов in vitro - патент РФ 2027757

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

www.freepatent.ru

Способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (panicum miliaceum l.) с использованием теплового стресса

Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов в культуре пыльников проса. Изолированные пыльники высаживают на поверхность агаризованной среды MSB, дополненную 2 мг/л 2,4-Д. Культуру пыльников in vitro выдерживают в термостате +32°С в течение 1 суток. После теплового стресса пыльники культивируют при +24°С и 16 часовом световом дне. Сформированные эмбриогенные каллусные ткани для стимулирования регенерационного процесса помещают на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК. Регенерирующие каллусные ткани переносят на среду MSB без регуляторов роста. Полученные в условиях этой среды корнесобственные растения-регенеранты высотой 1,5 см переводят в почву. Изобретение позволяет эффективно получать растения-регенеранты. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов в культуре пыльников проса, и может быть использовано в генетике, физиологии и селекции.

Впервые в культуре пыльников растения-регенеранты получены у вида Datura inoxia Mill. [1, 2]. Предобработка бутонов холодом (+4°С) обеспечила увеличение числа растения-регенерантов в культуре пыльников Nicotiana tabacum L. и Datura innoxia Mill. в несколько раз [3]. Обработка холодом является наиболее распространенным стрессовым воздействием на микроспоры таких злаковых культур, как пшеница, ячмень, рис, кукуруза.

Для формирования культуры пыльников проса использовали изолированные метелки, подвергшиеся стрессу низких положительных (+4°С) температур в течение 1...5 суток. Тепловой стресс ранее не применялся к культуре пыльников проса. Использование обработки метелок холодом с последующим культивированием изолированных пыльников в условиях улучшенных вариантов среды N6 давало положительный эффект, однако частота формирования эмбриогенных каллусов не превышала 4% [4].

Предложенное стрессовое воздействие теплом на изолированные пыльники проса позволяет заметно повысить эффективность получения эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов. В отдельных вариантах частота эмбриогенного каллусогенеза достигает 28,3%. В вариантах с тепловым стрессом на 30 высаженных пыльников получено 61,3 зеленых растения-регенеранта, в то время как после обработки холодом 46, а в контроле 19.

Изолированные пыльники высаживают на поверхность агаризованной среды MSB (среда MS с витаминами В5), дополненную 2 мг/л 2,4-Д. Культуру пыльников in vitro выдерживают в термостате +32°С в течение 1 суток. После теплового стресса пыльники культивируют при +24°С и 16 часовом световом дне. Сформированные эмбриогенные каллусные ткани для стимулирования регенерационного процесса помещают на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК. Регенерирующие каллусные ткани переносят на среду MSB без регуляторов роста. Полученные в условиях этой среды корнесобственные растения-регенеранты высотой 1,5 см переводят в почву.

Пример. Использовали пыльники растущих в тепличном боксе растений сорта Благодатное и гибридов F2: Могарообразное 2172 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171, Соргообразное 2171 × Благодатное, Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172, Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное.

Использовали изолированные пыльники с пыльцой на mid-uninucleate ...early dinucleate стадиях развития. Изучали два типа стрессовых воздействия: тепло и холод. Обработке холодом (+4°С) в течение 6 суток подвергали срезанные метелки. Тепловой (+32°С) стресс различной продолжительности применяли к изолированным пыльникам in vitro, помещенным на поверхность агаризованных сред. В контрольном варианте пыльники изолировали из цветков свежесрезанных метелок и не подвергали стрессовым воздействиям. Каллусогенная среда была основана на протоколе MSB: MS [5] с витаминами В5 [6] и дополнительно содержала 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Для стимулирования регенерационного процесса эмбриогенные каллусы переносили на среду MSB с 0,5...1,0 мг/л НУК-α-нафтилуксусная кислота и 10 мг/л БАП - 6-бензиламинопурин. Регенерация корнесобственных растений проса продолжалась в условиях среды MSB без регуляторов роста [7].

В 2004 г. изучали влияние теплового стресса (+32°С) различной продолжительности на эффективность эмбриогенного каллусогенеза. В варианте без стрессового воздействия (контроль) частота каллусогенеза составила 1,1% (табл.1). В варианте с обработкой пыльников теплом в течение 1 суток средняя частота формирования эмбриогенных каллусов составила 14%. При этом в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное частота равнялась 5% (3,3% в контроле). В варианте сорта Благодатное частота была равна 3,3% (0% в контроле). Наибольшее число эмбриогенных каллусов (28,3%) наблюдали в варианте гибрида Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное. Стрессовое воздействие на культуру пыльников теплом в течение 2 суток обеспечивало среднюю частоту эмбриогенного каллусогенеза 3,3%. В варианте сорта Благодатное частота равнялась 6,7%. Однако у гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное она была равна нулю. Обработка пыльников теплом в течение 3 суток в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное определила частоту 1,7%, что соответствовало контрольному варианту.

В 2005 г. изучали влияние двух видов стрессовых воздействий: обработку пыльников теплом (+32°С) in vitro и метелок проса холодом (+4°С) на эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации. Всего в контроле было высажено 300 пыльников. В вариантах с тепловым и холодовым стрессами высажено, соответственно, 750 и 210 пыльников. С каждого гибридного растения изолировали и помещали на каллусогенную агаризованную среду 30 пыльников. Для того чтобы уменьшить влияние на результат неподходящих для эмбриогенеза стадий развития пыльцы анализировали только те посадки по 30 пыльников, в которых было не менее 1 эмбриогенного каллуса. В опыте использовали генетически близкие гибриды (табл.2).

Средняя частота формирования эмбриогенных каллусов в варианте с обработкой теплом (120 пыльников) составила 9,2%. Средняя частота эмбриогенного каллусогенеза в варианте с обработкой холодом (90 пыльников) равнялась 4,4%. В контроле (30 пыльников) частота была равна 3,3%.

Среднее число всех регенерантов, приходящееся на 30 пыльников, в варианте с тепловым стрессом равнялось 78,3. В варианте с холодом среднее число регенерантов составило 43,3. В контрольном варианте получено 38 регенерантов. После обработок теплом, холодом и в контроле получено, соответственно, 61,3; 42; 19 зеленых регенерантов на 30 пыльников. Процент зеленых регенерантов был, соответственно, равен 78,3; 96,9; 50.

По результатам опытов 2004 и 2005 гг. установили, что тепловая обработка изолированных пыльников при температуре +32°С в течение 1 суток заметно повышает эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников проса в сравнении с контролем и другими стрессовыми воздействиями. Особого внимания заслуживает факт массового (28,3%) формирования эмбриогенных каллусов в варианте с тепловым стрессом.

Источники информации

1. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura//Nature. - 1964. - V.204.

2. Guha S., Maheshwari S.C. Development of embryoids from pollen grains of Datura in vitro. Phyromorphalogy. - 1967. - V.17.

3. Nitsch С., Noreel В. Effet d'um choc thermiquesur le pouvoir embryogenedu pollende Datura innoxia cultive dansl'anthere ou isole de l'anthere. //C.R.Acad. Sci. (Paris). Ser. D. - 1973. - V.276.

4. Патент РФ на изобретение №2217907. Способ получения регенерантных растений в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) /С.В.Бобков/ Заявка №2001121609/13. Приоритет 31.07.2001. Зарегистрирован 10.12.2003. Бюл. №34.

5. Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures//Physil. Plant. - 1962. - V.15. - №13. - P.473-497.

6. Gamborg O., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley//Can. J. Biochem. - 1968. - V.46. - №5. - Р.417-421.

7. Бобков С.В. Получение регенерантов проса и просовых культур. //Доклады Россельхозакадемии. - 2005. - №6. - С.5-7.

Способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) с использованием теплового стресса, включающий получение эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов, отличающийся тем, что для эффективного формирования эмбриогенных каллусов изолированные пыльники in vitro в условиях питательной среды MSB с 2 мг/л 2,4-Д выдерживают в термостате при температуре +32°С в течение 1 сут, а затем культивируют при +24°С и 16-часовом световом дне, для стимулирования регенерационного процесса каллусы переносят на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК, а для получения корнесобственных растений-регенерантов регенерирующие каллусные ткани помещают на среду MSB без регуляторов роста.

www.findpatent.ru

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (i. ensata thunb.) in vitro

Изобретение относится к способу получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro. Способ включает стерилизацию бутонов при условии, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП. Затем культивируют и укореняют. При этом через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ. Изобретение позволяет получать растения-регенеранты прямым методом, минуя каллусную культуру, с высоким процентом укоренения. 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию органов и тканей растений, и может быть использовано в цветоводстве для повышения коэффициента размножения, оздоровления посадочного материала, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов I.ensata.

Известен способ получения растений-регенерантов I.ensata, согласно которому в качестве эксплантов используют молодые побеги. Их культивируют на среде Мурасиге-Скуга, дополненной гормонами и сахарозой. Наблюдают индукцию двух видов каллуса: зеленого и белого. Из зеленого каллуса были получены побеги. Введение активированного угля в питательную среду положительно влияло на образование корней у этих побегов (Yabuya Т, Ikeda Y., Adachi Т. (1991) In vitro propagation of Japanese garden iris iris ensata Thunb. // Euphytica 57, P.77-82).

Недостатком данного способа (аналога) является следующее. Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза не пригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как повышается вероятность сомаклональной изменчивости исходного материала.

Наиболее близким является способ получения растений-регенерантов I.ensata на основе индукции развития почек в эксплантах околоцветник - завязь прямым путем, минуя каллусообразование. Экспланты культивировали на питательных средах Мурасиге-Скуга, дополненных фитогормонами НУК(α-нафтилуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин) в количестве 0-5 мг/л. Отмечена высокая способность к побегообразованию у данного типа эксплантов. Укоренить побеги автору не удалось (Kawase К, Mizutani Н, Yoshioka М, Fukuda S (1995) Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro // Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 64, P.143-8).

Недостатками данного способа является отсутствие способности к укоренению у полученных побегов I.ensata.

Наиболее близким является способ прямой регенерации флоральных элементов в ткани трубки околоцветника I.ensata. Бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. Следующий этап обеззараживания проводили в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Части цветка делили на фрагменты 3×3 мм. В качестве эксплантов использовали фрагменты трубки околоцветника. Экспланты высаживали на питательные среды на основе MS (по прописи Мурасиге и Скуга), дополненные фитогормонами: 1-нафтилуксусной кислотой (НУК) 3-5 мкМ и 6-бензиламинопурином (БАП) 4-8 мкМ. Данным способом трубка околоцветника I.ensata способна регенерировать флоральные элементы (Тихомирова Л.И. Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro // Turczaninowia. 2010. - №13 (3). - C.147-151).

Недостатками данного способа (прототипа) является отсутствие способности к размножению и укоренению полученных флоральных элементов I.ensata, a также отсутствие подтверждения идентичности материнским экземплярам.

Задачей изобретения является создание способа получения растений-регенерантов, идентичных материнским растениям I.ensata, способных к дальнейшему размножению и укоренению.

Сущность изобретения

Способ получения растений-регенерантов I.ensata, заключающийся в том, что образование побегов осуществляется непосредственно из ткани экспланта, минуя стадию каллусообразования, зачатки побегов с флоральными элементами разделяют и пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и полноценные вегетативные побеги укореняют на среде с НУК 3 мкМ.

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro, заключающийся в том, что бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают каждый фрагмент на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, затем культивируют и укореняют, а через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ.

Способ обеспечивает высокий процент выхода генетически стабильных регенерантов. Для подтверждения идентичности материнским экземплярам проводят анализ методом RAPD полногеномной ДНК.

Способ реализуют следующим образом.

Получение растений-регенерантов I.ensata осуществляют в два этапа, в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника.

1 этап. Цветки берут в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обертки. Стерилизацию материала проводят в условиях ламинар-бокса. Бутоны цветка, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, далее проводят обеззараживание в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Подобный способ обеспечивает на 100% стерильность и жизнеспособность материала. Части трубки околоцветника делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи Мурасиге и Скуга, содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в разных концентрациях: 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, всего девять вариантов сред (таблица 1) pH среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры по 30 мл или в культуральные флаконы по 10 мл. Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26°С.

В первые две недели культививования in vitro все экспланты увеличиваются в размерах и приобретают зеленую окраску. Далее еще через две недели в тканях экспланта развиваются зачатки вегетативных побегов, у которых вместо примордиев первых листьев формируются структуры, похожие на доли околоцветника - флоральные элементы. Со временем эти структуры приобретают характерную для цветков данного сорта окраску (Фиг.1).

2 этап. Для получения вегетативных побегов I.ensata из фрагментов трубки околоцветника готовят питательные среды. Зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды (используются среды Мурасиге-Скуга или Гамборга B5), содержащие 20 мкМ БАП (таблица 2). Этап, во время которого из эксплантов формируются вегетативные побеги, характеризуется как промежуточный. Через 30 дней регенерируют полноценные побеги с зелеными листьями. В результате данным способом через 60 суток получают полноценные вегетативные побеги I.ensata в количестве 5-8 штук на один эксплант (Фиг.2), которые укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ. А после этапа укоренения получают растения-регенеранты, идентичные материнским экземплярам. Для подтверждения идентичности растений-регенерантов и материнских растений I.ensata проводят анализ с помощью ПЦР (Фиг.3).

Необходимым условием клонального микроразмножения является стабильное воспроизводство исходного генотипа. Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызвать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности полученных регенерантов. Методом RAPD-анализа полногеномной ДНК отличий между материнскими экземплярами I.ensata и растениями-регенерантами, полученными методом прямой регенерации побегов из ткани экспланта трубки околоцветника, не обнаружено.

Способом получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro получают побеги в количестве 5-8 штук на один эксплант, способные к дальнейшему размножению и укоренению. Высокий процент укоренения до 100% достигается на средах Мурасиге и Скуга, дополненных 3 мкМ НУК.

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro, включающий стерилизацию бутонов, заключающийся в том, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, затем культивируют и укореняют, отличающийся тем, что через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ.

www.findpatent.ru

Способ получения растений-регенерантов

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения растений-регенерантов различных культур. Проводят подготовку к посадке регенерируемых частей растений путем помещения и удерживания их совместно с другим биологическим объектом в металлической камере, защищающей от воздействия внешних электромагнитных полей в течение семи суток. Посадку выполняют введением частей растений как в стерильную культуру (in vitro), так и в нестерильную культуру (in vivo). Изобретение позволяет в более короткие сроки и с большим выходом получать необходимое количество посадочного материала растений с улучшенными хозяйственно-полезными признаками.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессах размножения различных культур, в исследованиях по изменению хозяйственно-полезных признаков растений под воздействием биоэнергетического информационного излучения.

Известны способы получения растений-регенерантов, включающие использование частей растений (семян, побегов, соцветий, луковиц, почек, корней, клубней) путем выделения из этих частей эксплантов, их последующую подготовку к посадке и посадку (см. Н.В.Катаев, Р.Г.Бутенко, Клональное микроразмножение растений, М., Наука, 1983 г.; B.C.Шевелуха, Е.А.Калашников, Е.С.Воронин и др., Сельскохозяйственная биотехнология, Учеб. /2-е изд., перераб. и доп., М., Высшая школа, 2003 г.).

Известен способ получения частей растения, с их последующей подготовкой и высадкой в стерильную культуру (in vitro) на примере такого растения, как бегония (см. A.Lida, К.Yabe, L.Wasida, V.Saburai, Mass propagation of Begonia tuberhybrida Voss. Piantiets using tissue cuiture, Res. Bull. Aichi. - Ken Agr. Res. Center. Nakagute, Aigchi. 1986, №18, p.186-190).

К недостаткам известных способов получения растений-регенерантов можно отнести небольшой выход жизнеспособных эксплантов, малое количество одновременно получаемых растений-регенерантов, низкую скорость роста культивируемых растений.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков.

Поставленная задача решается следующим образом: в способе получения растений-регенерантов, включающем использование частей растений, их подготовку к посадке и посадку, согласно изобретению подготовку к посадке осуществляют путем воздействия на части растений (путем обработки частей растений) информационным (биоэнергетическим информационным) полем какого-либо биологического объекта в условиях (в режиме) взаимности (взаимного влияния, биообмена), например, другого растения, причем посадку выполняют введением частей растений как в стерильную культуру (in vitro), так и в нестерильную культуру (in vivo).

Таким образом, достигаются следующие технические результаты: ускорение процесса размножения, повышение выхода посадочного материала, благодаря биоэнергетической информационной поддержке (стимуляции) частей растений биологическим объектом (например, другим растением) в момент (в период) его активного информационного самоизлучения и получение новых хозяйственно-полезных признаков у размножаемых растений.

Способ получения растений-регенерантов поясняется практическими примерами осуществления (его реализации), подтверждающих достоверность полученного эффекта результатами сравнительных исследований.

Пример №1. В качестве частей растения или растения-приемника использовались листья сенполии сорта «Blue Dragons и сорта «Fredettes Risen Star», а в качестве биологического объекта брали, например, другое растение или растение-излучатель, а именно трехдневные проростки кукурузы. Далее выполнялась подготовка к посадке растения-приемника следующим образом: части растения помещали в три изолированные от внешней среды и от воздействия внешних электромагнитных и энергоинформационных полей металлические камеры (№1, №2, №3). Там же размещали биологический объект, например, другое растение или растение-излучатель, а именно трехдневные проростки кукурузы, которые в течение 7 суток (этот срок определяется временем активного информационного самоизлучения проростка кукурузы) воздействовали своим информационным полем (биоэнергетическим информационным полем) на части растения-приемника, то есть листья сенполии. О примерах косвенного доказательства такого воздействия см. например: А.В.Чернетский, О физической природе биоэнергетических явлений и их моделировании, М., 1989 г.; О.В.Бецкий, Миллиметровые волны в биологии и медицине, Радиотехника и электроника, 1993 г, т.38, вып.10, стр.1760-1782 и др. Поскольку растение-приемник и растение-излучатель располагались и находились в замкнутом пространстве и рядом (близко) друг к другу, то есть обеспечивалось локальное размещение растений, то возникают условия взаимности информационного воздействия, взаимного влияния информационных полей растений друг на друга, обеспечивается режим биообмена. Затем листья сенполии извлекали из каждой камеры и поверхностно стерилизовали 0,1%-ным раствором сулемы в течение 5 минут, несколько раз промывали стерильной дистиллированной водой, после чего их делили на фрагменты (5х5 мм) и помещали на искусственные питательные среды Мурасиге и Скуга, дополненные регуляторами роста. Таким образом, части растения вводили в стерильную культуру (in vitro). В качестве контроля были использованы листья обоих сортов сенполии, срезанные с растений и поверхностно простерилиэованные таким же образом. В течение последующих 30 дней проводили наблюдения и учитывали количество жизнеспособных эксплантов, а еще через 30 дней - интенсивность регенерации. После роста на среде для укоренения, растения были высажены в нестерильные условия (in vivo) и выращивались до наступления цветения.

В результате обработки листьев сенполии информационным полем трехдневного проростка кукурузы, через месяц культивирования, получили следующие результаты: жизнеспособность эксплантов по сравнению с контрольными в камере №3 возросла и составила для сорта «Fredettes Risen Star» - 56%; контрольный - 11%; для сорта «Blue Dragon» в камерах №1 и №2 соответственно 53% и 39%; контрольный - 35%.

Количество растений-регенерантов на эксплантах из листьев, обработанных информационным полем, было в два раза больше по сравнению с контрольными, а сроки культивирования сократились на 7-10 суток, что позволило перевести их раньше на среду для укоренения. Кроме того, растения-регенеранты отличались от контрольных тем, что они имели интенсивную зеленую окраску. Это было характерно для растений-регенерантов обоих сортов сенпопии. Таким образом, регенерационные способности существенно выросли.

Растения, прошедшие обработку информационным полем, имели более крупные листья и черешки (на 20-50%), чем контрольные; листья располагались в розетке более компактно; массовое цветение у них наблюдалось через 6 месяцев, тогда как у контрольных - через 12 месяцев. Форма и окраска цветов в опыте и контроле - не отличались.

Аналогичные результаты были получены при введении частей растений как в стерильную культуру (in vitro), так и в нестерильную культуру (in vivo).

Пример №2. В качестве частей растения использовались семена подсолнечника, а в качестве биологического объекта брали другое растение - проростки пшеницы сорта «Алтайская-100». Далее семена подсолнечника помещали в изолированные от внешней среды и от воздействия внешних электромагнитных и энергоинформационных полей металлические камеры и в течение 7 суток обрабатывали информационными полями проростков пшеницы, поместив их в непосредственной близости с семенами, для обеспечения условий взаимности информационного воздействия, условий биообмена. По окончании обработки, семена стерилизовали в течение 20 минут в 0,2% растворе сулемы, четырежды промывали дистиллированной стерильной водой и в стерильных условиях ламинар-бокса снимали с семян наружные покровы. От каждого семени отделяли семядоли, которые делили пополам в продольном направлении. Таким образом, от одного семени получали по 4 фрагмента семядолей и зародыш. Полученные фрагменты помещали на искусственные питательные среды Мурасиге и Скуга, дополненные различными регуляторами роста. Изолированные же зародыши культивировали на безгормональной среде Мурасиге и Скуга. В качестве контроля использовали фрагменты семядолей подсолнечника, изолированные от зародышей, поверхностно простерилизованные и культивированные таким же образом. Через две недели после введения в культуру in vitro подсчитывали число и % жизнеспособных эксплантов, а еще через 6 недель - регенерационную способность эксплантов.

В результате эксперимента выяснилось: жизнеспособность обработанных информационным полем проростков пшеницы, фрагментов семядолей подсолнечника составила 93-100%; контрольных - 67-80%. Жизнеспособность зародышей соответственно - 93%; контрольных - 60%. Регенерационные способности также отчетливо выявились. Только фрагменты семядолей опытных семян проявили способность к регенерации корней, почек и соматических эмбриоидов. Изолированные зародыши росли на безгормональных средах и имели нормальную морфологию только в опытных, обработанных информационным полем образцах. В контрольных же все они имели ненормальную морфологию из-за гипергидратации всех тканей: утолщенный гипокотиль, плохо развитые корни и укороченный побег.

Пример №3. В качестве части растения использовался лист бегонии, а в качестве биологического объекта - инкубируемое куриное яйцо. Лист бегонии срезали с растения и, обернув срез черенка смоченной в воде ватой, помещали его в металлическую камеру, защищающую лист от воздействия внешних электромагнитных полей, и предпринимали меры по защите листа от влияния повышенной температуры. Затем в течение 7 суток воздействовали на лист информационным полем инкубируемого яйца в условиях биообмена. В этом случае камера с листом и куриным яйцом находилась в инкубаторе, где были созданы условия для развития зародыша в инкубируемом яйце. Известно, что особенно интенсивно зародыш растет в первые сутки: его масса увеличивается более чем в десять раз (см. Инкубаторы / Сост. А.Ф.Зипер - М.: ООО Издательство АСТ; Донецк: Сталкер, 2001. - с.52). Поэтому обработка производилась с первого дня инкубирования. По окончании срока воздействия лист бегонии разрезали на фрагменты с сохранением в каждом из них по одной крупной жилке. Полученные фрагменты помещали в чашку Петри вертикально (морфологически нижним концом вниз) между слоями фильтрованной бумаги, сложенной «гармошкой» и смоченной кипяченой водой. В качестве контроля использовали фрагменты, полученные из листа бегонии, срезанного с того же растения, который не подвергался воздействию информационных полей. Указанные изолированные фрагменты листа бегонии помещали в чашку Петри таким же образом. Через каждые две недели в течение двух месяцев учитывали выживаемость фрагментов, укореняемость, побегообразование и длину корней. Полученные результаты приведены ниже:

В результате эксперимента выяснилось: корне- и побегообразование быстрее наступили у фрагментов листа бегонии, обработанного информационным полем куриного яйца. К концу эксперимента в опытной группе побегообразование было больше на 30% по сравнению с контрольной. Развивающиеся побеги в опытной группе опережали по росту и развитию побеги в контрольной группе. Таким образом, информационное поле куриного яйца оказало существенное влияние на регенерационные сроки (в опытной группе на 2 недели раньше отмечено корнеобразование и на 4 недели раньше - побегообразование).

Использование предлагаемого способа позволит в более короткие сроки и с большим выходом получать необходимое количество посадочного материала растений с улучшенными хозяйственно-полезными признаками.

Способ получения растений-регенерантов, включающий подготовку частей растений к посадке и посадку, отличающийся тем, что подготовку к посадке осуществляют путем помещения и удерживания регенерируемых частей растений совместно с другим биологическим объектом в металлической камере, защищающей от воздействия внешних электромагнитных полей в течение семи суток, причем посадку выполняют введением частей растений как в стерильную культуру (in vitro), так и в нестерильную культуру (in vivo).

www.findpatent.ru

Смотрите также

• 
  Растение гурман
• 
  Просистематизировать растение
• 
  Лохан растение
• 
  Жаростойкость растений
• Анаграмма растения
• 
  Самовоспроизведение растений
• 
  Анемония растение
• 
  Растение шивы
• 
  Растение порфира
• 
  Растение порфира
• 
  Растение павлония