Принципы создания трансгенных растений. Цели создания трансгенных растений

Принципы создания трансгенных растений.

Любые студенческие работы ДОРОГО, КАЧЕСТВЕННО

Узнать стоимость работы

Одним из исходных научных положений метода, позволившего осуществлять различные действия с генами, является открытие ферментов, названных  рестрикционными  эндонуклеазами  или  рестриктазами.  Эти ферменты  способны  распознавать  определенную  последовательность

«своей» ДНК и расщеплять «чужую» ДНК на мелкие фрагменты. В настоящее  время  выделены  рестриктазы,  распознающие  более 150  мест расщепления ДНК.

Установлено, что рекриктазы могут быть мелко- и крупнорасщепляющими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы больше разрывов,  чем  вторые,  узнающие  последовательность  из 6  нуклеотидных  пар. Следует  отметить,  что рестриктазы по-разному расщепляют ДНК –  одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, другие – со сдвигом с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором – «липкие» концы, т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные (комплементарность в биохимии – взаимное соответствие в химическом строении двух  макромолекул,  обеспечивающее  их  взаимодействие –  спаривание двух нитей ДНК,  соединение фермента  с  субстратом,  антигена  с  антителом; комплементарные структуры подходят друг к другу как ключ к замку) участки длиной в 4 нуклеотида. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК (рекомбинантные ДНК – это ДНК, образованные объединением  in vitro двух или более фрагментов ДНК,  выделенных из различных биологических источников).

Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:

– сшивка по одноименным «липким» концам – любые два фрагмента ДНК, независимо от их происхождения, образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов;

– сшивка по «тупым» концам – менее эффективный метод, поэтому для  получения  рекомбинантных  молекул  ДНК  пользуются «липкими» концами;

–  сшивка  фрагментов  с  разноименными «липкими»  концами –  для связи  разноименных,  то  есть некомплементарных  друг  другу «липких» концов,  используют  так  называемые линкеры или «переходники» (линкеры –   это  химически  синтезированные  олигонуклеотиды,  представ-ляющие  собой  сайты (англ.  site – место),  рестрикции (места  расщепления) или их комбинацию; существуют большие наборы линкеров, в том числе «тупой конец – липкий конец»). После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки  и  обеспечить  стабильное  поддержание  генетической  информации, что достигается с помощью, так называемых, векторных молекул. 

Векторными молекулами, или векторами, называют молекулы ДНК, способные  акцептировать (от  лат.  acceptus –  принятый)  чужеродную ДНК и обеспечивать ее репликацию (от позднелат. replicatio – повторение,  удвоение  молекул  ДНК (у  некоторых  вирусов  РНК)  при  участии специальных ферментов;  репликацией  называется  также  удвоение  хромосом,  в  основе  которого  лежит  репликация ДНК;  репликация  обеспечивает  точное  копирование  генетической  информации,  заключенной  в молекулах ДНК, и передачу ее от поколения к поколению), возможно, и экспрессию (экспрессия гена – проявление генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипического признака). Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В  качестве  векторов используют,  как  правило,  плазмиды,  бактериофаги, вирусы животных.

К векторной молекуле предъявляются следующие требования:

–  она  должна  иметь  область,  чувствительную  к  определенной  рестриктазе,  которая,  расщепляя  вектор  в  одном  участке,  превращает  его кольцевую форму в линейную; к линейной ДНК «пришивают»  ген или гены и затем снова замыкают ее в кольцо, а рекомбинантную ДНК вводят в живые клетки;

– вектор должен реплицироваться в определенных клетках;

– в составе векторной молекулы должен быть маркерный (от франц. marquer - отмечать) ген, который после проникновения вектора в клетку придает  ей  фенотип (в  биологии –  совокупность  всех  признаков  и свойств организма, сформировавшихся в процессе  его индивидуального развития),  свидетельствующий  о присутствии  вектора. В  качестве маркерного  гена,  как  правило,  используют  гены  устойчивые  к  антибиотикам, чаще всего устойчивые к ампициллину. При создании трансгенных растений применяют природный генный вектор, возникший в организме почвенных  бактерий (Agro-bacteria).

В  генной  инженерии  используют  в  основном  почвенные  бактерии Agrobacterium tumefacies  и  Agrobacterium rhizogenes. В  зависимости  от типа  плазмиды  Ti (в  случае  A. tumefaciens)  либо  Ri (в  случае  А. rhizogenes), попав  в  организм  растения,  они начинают  экспрессировать чужеродные  гены (онкогены),  что  приводит  к  образованию  опухолей. Ученые научились «обезоруживать» Ti- и Ri- плазмиды, заменяя онкогены  в  переносимой  части  плазмид (так  называемая  Т-ДНК)  на  те  гены, которые необходимо ввести в растение. Один из способов введения чужеродной ДНК заключается в использовании промежуточного вектора.

Сущность этого способа состоит в том, что Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. cоli например pBR 322. Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные  методы,  встраивают  чужеродный  ген  внутрь  Т-области  и  вновь  размножают  с  уже  вставленным  геном.  Затем  полученную  рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущую полную Ti-плазмиду.

В результате двойной рекомбинации между гомологичными (от греч. homologos –  соответственный,  подобный),  областями  Т-ДНК  часть  рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti  -плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Бактериями, имеющими  Ti-плазмиду  со  встроенными  генами,  заражают  растения,  в  результате чего образуются опухоли – корончатый галл. Начинается перестройка  метаболизма  клеток,  которые  будут  содержать  Ti-область  со встроенным в него чужеродным геном.

Существуют  и  другие  методы  введения  чужеродной  генетической информации: применение бинарных векторов; векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений; прямого переноса генов. Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных.

Сущность этого метода заключается в том, что на мельчайшие частицы золота или вольфрама, диаметром 0,6–1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые или  золотые частицы, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помешаются внутрь биологической баллистической (биолистической)  пушки.  Они  с  огромной  скоростью  выбрасываются  из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница,  ячмень.  При  этом  были  получены  стабильные  растения трансформанты.

students-library.com

Методы создания трансгенных продуктов | Принас

Создать генноизмененное растение на данном этапе развития науки для генных инженеров не составляет большого труда. Существует несколько достаточно широко распространенных методов для внедрения чужеродной ДНК в геном растения.

Метод 1:

Существует бактерия Agrobacterium tumefaciens (Лат.- полевая бактерия, вызывающая опухоли), которая обладает способностью встраивать участки своей ДНК в растения, после чего пораженные клетки растения начинают очень быстро делиться и образуется опухоль. Сначала ученые получили штамм этой бактерии, не вызывающий опухолей, но не лишенный возможности вносить свою ДНК в клетку. В дальнейшем нужный ген сначала клонировали в Agrobacterium tumefaciens и затем заражали уже этой бактерией растение. После чего инфицированые клетки растения приобретали нужные свойства, а вырастить целое растение из одной его клетки сейчас не проблема.

Метод 2:

Клетки, предварительно обработанные специальными реагентами, разрушающими толстую клеточную оболочку, помещают в раствор, содержащий: ДНК и вещества, способствующие ее проникновению в клетку. После чего как и в первом случае выращивали из одной клетки целое растение.

Метод 3:

Существует метод бомбардировки растительных клеток специальными, очень маленькими вольфрамовыми пулями, содержащими ДНК. С некоторой вероятностью такая пуля может правильно передать генетический материал клетке и так растение получает новые свойства. А сама пуля ввиду ее микроскопических размеров не мешает нормальному развитию клетки.

Итак, задача, которую надо решить при создании трансгенного растения - организма с такими генами, которые ему от природы "не положены", - это выделить нужный ген из чужой ДНК и встроить его в молекулу ДНК данного растения. Процесс этот весьма сложен.

Ниже рассмотрена операция по пересадке гена.

Более четверти века назад были открыты ферменты рестриктазы, разделяющие длинную молекулу ДНК на отдельные участки - гены, причем эти кусочки приобретают "липкие" концы, позволяющие им встраиваться в разрезанную такими же рестриктазами чужую ДНК.

Самый распространенный способ внедрения чужих генов в наследственный аппарат растений - с помощью болезнетворной для растений бактерии Agrobacterium tumefaciens (в буквальном переводе с латыни - полевая бактерия, вызывающая опухоли). Эта бактерия умеет встраивать в хромосомы заражаемого растения часть своей ДНК, которая заставляет растение усилить производство гормонов, и в результате некоторые клетки бурно делятся, возникает опухоль. В опухоли бактерия находит для себя отличную питательную среду и размножается. Для генной инженерии специально выведен штамм агробактерии, лишенный способности вызывать опухоли, но сохранивший возможность вносить свою ДНК в растительную клетку.

Нужный ген "вклеивают" с помощью рестриктаз в кольцевую молекулу ДНК бактерии, так называемую плазмиду. Эта же плазмида несет ген устойчивости к антибиотику. Лишь очень небольшая доля таких операций оказывается успешной. Те бактериальные клетки, которые примут в свой генетический аппарат "прооперированные" плазмиды, получат кроме нового полезного гена устойчивость к антибиотику. Их легко будет выявить, полив культуру бактерий антибиотиком, - все прочие клетки погибнут, а удачно получившие нужную плазмиду размножатся. Теперь этими бактериями заражают клетки, взятые, например, из листа растения. Опять приходится провести отбор на устойчивость к антибиотику: выживут лишь те клетки, которые приобрели эту устойчивость от плазмид агробактерии, а значит, получили и нужный нам ген. Дальнейшее - дело техники. Ботаники уже давно умеют вырастить целое растение из практически любой его клетки (см. "Наука и жизнь" № 3, 1986 г.).Однако этот метод "работает" не на всех растениях: агробактерия, например, не заражает такие важные пищевые растения, как рис, пшеница, кукуруза. Поэтому разработаны и другие способы. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, и поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее ее проникновению в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль). Иногда в мембране клеток проделывают микроотверстия короткими импульсами высокого напряжения, а через отверстия в клетку могут пройти отрезки ДНК. Иногда применяют даже впрыскивание ДНК в клетку микрошприцем под контролем микроскопа.

www.prinas.org

Создание трансгенных растений

studopedya.ru

Технологии создания гм-растений

Как уже отмечалось, в практике создания новых или улучшенных сортов сельскохозяйственных растений все большее значение приобретает прямое генетическое воздействие на растительный организм. В результате такого вмешательства получается трансгенный организм, геном которого содержит чужеродный генетический материал [5, 34, 47].

Общая схема создания трансгенных растений представлена на

Схема создания генетически модифицированных растений

Основные этапы этого процесса включают:

1) получение целевых генов, предназначенных для введения в растение, и конструирование кассеты экспрессии;

2) конструирование вектора, несущего целевой ген;

3) трансформацию растительных клеток;

4) регенерацию целого растения из трансформированной клетки;

5) детектирование трансформированных растений среди регенерантов.

Получение целевых генов. На первом этапе необходимо получить ген, который будет вводиться в реципи-ентную клетку растения-хозяина. Для этого существует несколько возможностей.

Если расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК и картированы гены донорного организма (т.е. известно, какие фрагменты этой ДНК кодируют те или иные признаки), то нужный ген может быть вырезан специальными ферментами рестриктазами из геномной ДНК донора. Другим способом получения целевого гена является химический или ферментативный синтез нужного фрагмента ДНК. И, наконец, искомую нуклеотидную последовательность можно получить ферментативным синтезом ДНК с матричной РНК — кДНК. Таким образом, в результате реализации того или иного способа получают фрагмент ДНК, несущий ген, кодирующий необходимый признак.

Для того чтобы ген после введения его в организм нового хозяина экспрессировался, т.е. работал, и, как результат этого, в клетке синтезировался соответствующий белок, необходимо снабдить его регуляторными элементами. Регуляторные элементы представляют собой определенные последовательности нуклеотидов, которые позволяют гену функционировать. Обязательными компонентами регуляторных элементов являются:

♦ промотор — участок молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза (фермент, катализирующий синтез мРНК), что сопровождается инициацией транскрипции гена;

♦ терминатор — участок молекулы ДНК, определяющий окончание синтеза молекулы мРНК.

В качестве промотора чаще всего используют сильный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Он относится к конститутивным промоторам, т.е. таким, которые работают на протяжении всей жизни растения. Иногда требуются специфические промоторы — такие, которые активны в отдельных клетках, тканях, органах или лишь на определенных стадиях жизни растений. Например, есть промоторы, которые работают только в клубнях картофеля и никогда не будут работать в его листьях. Наконец, существуют индуцибельные промоторы, которые активируются только под воздействием определенных факторов — химических веществ, температуры и др. В зависимости от того, какой ген должен быть перенесен в растение и в какой период он должен экспрессироваться, для создания вектора выбирают тот или иной промотор.

Таким образом, кассета экспрессии представляет собой группу функционально связанных участков ДНК, в состав которой входят промотор, целевой ген и терминатор.

Конструирование вектора. Сама по себе кассета экспрессии не может попасть в клетку-реципиент и интегрироваться (внедриться) в хромосомы растения-хозяина. Для этого нужен вектор — специальная молекула ДНК, которая может проникать в клетки растений и там самореплицироваться, либо встраиваться в ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ней.

В качестве вектора обычно используют ДНК вируса или бактериофага, а также плазмиды бактерий (кольцевые молекулы ДНК, несущие небольшое количество генов и присутствующие в бактериальной клетке наряду с хромосомной ДНК). Именно плазмиды чаще всего применяются для трансформации растений.

Первые попытки создания таких векторных систем основывались на использовании 77-плазмиды (от англ. tumor-inducing plasmid) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens — фитопатоген, который инфицирует клетки растений, что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный

рост растения . Причем, эта бактерия может поражать только клетки двудольных растений.

Инфицирование растений A. tumefaciens и образование корончатого галла

Образование корончатого галла является результатом трех взаимосвязанных процессов:

1. Проникновение бактерии в клетку растения.

2. Интеграция в геном растительной клетки специфического сегмента плазмидной ДНК бактерии — Т-ДНК (от англ. transferred DNA — часть плазми-ды, индуцирующей развитие опухоли).

3. Экспрессия отдельных генов Т-ДНК. Инфекционный процесс начинается с прикрепления

A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, чаще всего у основания стебля. Поврежденное растение выделяет специфические фенольные соединения, которые активируют гены вирулентности (vir-гены), локализованные в участке Ti-плазмиды за пределами Т-ДНК .

Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки. После активации fir-генов Т-ДНК транспортируется в клетку. При этом она находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме происходит ее встраивание в хромосомную ДНК растения.

Генетическая карта 77-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках За пределами Т-ДНК находится кластер vir генов гены кодирующие ферменты катаболизма опина, и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в A. tumefaciens Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно

Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее интеграции в хромосомную ДНК растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Это происходит в результате экспрессии плазмидных генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез растительных гормонов ауксина (ИУК — индолилуксусная кислота) и цитокининов. Ауксин и цитокинины регулируют рост и

развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей.

При использовании 77-плазмиды в качестве вектора для генетической трансформации растений кассету экспрессии, содержащую целевой ген, встраивают в Т-ДНК, а затем такой модифицированной плазмидой, помещенной в бактерию A. tumefaciens, инфицируют клетки растений.

Несмотря на то что 77-плазмиды являются эффективными природными векторами, их использование имеет некоторые ограничения. Наиболее существенные из них следующие:

1. Ауксин и цитокинины, синтезируемые трансформированными 77-плазмидами клетками, подавляют регенерацию зрелых растений из этих клеток. Следовательно, при конструировании векторов на основе 77-плазмид гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

2. Ti-плазмиды имеют очень большой размер (200— 800 тыс. нуклеотидных пар), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера. Следовательно, участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

3. 77-плазмиды не реплицируются в кишечной бактерии Escherichia coli (именно в этих бактериях производят клонирование созданного вектора для получения множества его копий, которые в дальнейшем и будут использовать для трансформации растительных клеток). Следовательно, при конструировании векторов необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их воспроизводство в Е. coli.

Кроме манипуляций,, связанных с удалением из 77-плазмид определенных участков ДНК и введения в них сайта инициации репликации кишечной бактерии, в вектор включают специальный ген, который позволяет идентифицировать трансформированные клетки. Он дает возможность обнаружить клетки растений, несущие чужеродную ДНК в составе геномной ДНК трансформиро

ванного растения. Эти гены позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток — в этом случае они называются селективными маркерными генами, либо оценивать активность кодируемого ими фермента — регуля-торные гены. Испытано несколько десятков генов, которые можно использовать как селективные маркерные гены, и репортерных генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специальных методов .

Как правило, в качестве репортерных используют бактериальный плазмидный ген фермента, который обеспе-

Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток

чивает устойчивость трансформированных растительных клеток к тому или иному антибиотику. Чаще всего это ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину. В качестве селективных маркерных генов используют гены, которые кодируют ферменты, обеспечивающие устойчивость растительных клеток к антибиотикам или гербицидам. Так, в присутствии ка-намицина выживают только те клетки, которые синтезируют активную неомицинфосфотрансферазу. Поскольку этот ген бактериальный (прокариотический) и не может экспрессироваться в растениях, его ставят под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и терминатора. Это обеспечивает эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках. Однако следует отметить, что, по мнению экспертов-биотехнологов, присутствие некоторых генов и их продуктов может приводить к загрязнению коммерческого продукта. В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные растения.

Таким образом, осуществив всё необходимые модификации Ti-плазмид, получают вектор, пригодный для трансформации клеток растений.

Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и кроме кассеты экспрессии содержат следующие элементы:

♦ селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам;

♦ сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens; .

♦ правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений;

♦ полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Так как клонирующие векторы не содержат uir-генов, то они сами не могут проникать в клетки растения и интегрироваться в их геном. Существуют два способа решения этой проблемы.

В первом случае используют бинарную векторную систему. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (ori) и для Е. сой и для A. tumefaciens, но не несет u/r-генов. Все стадии клонирования проводят в E.coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens, которая несет модифицированную неонко-генную 77-плазмиду. 77-плазмида содержит vir-гены, но из нее удалена Т-ДНК. Таким образом, бактерия не может транспортироваться в клетку растения, но может обеспечить синтез продуктов vir-генов, которые способствуют встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. То есть, она выполняет роль помощника интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Коинтегративный клонирующий вектор, несущий нужный ген, содержит сайт инициации репликации (ori) только для Е. coli и не может автономно существовать в A. tumefaciens. Он также несет бактериальный селективный маркерный ген, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П), без которой невозможна интеграция в чужой геном, и фрагмент 77-плазмиды, гомологичный участку Т-ДНК неонкоген-ной 77-плазмиды. Неонкогенная 77-плазмида содержит левую фланкирующую последовательность (JI), vir-гены и сайт инициации репликации A. tumefaciens (ori). После рекомбинации коинтегративного клонирующего вектора и неонкогенной 77-плазмиды образуется рекомбинантная плазмида, Т-ДНК которой, несущая клонированный ген, может трансформировать клетки растений.

После накопления клонирующих векторов в Е. coli в нужном количестве и их выделения из этих бактерий возможно использование рекомбинантных ДНК для трансформации растительных клеток.

 Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А - бинарный, Б - коинтегративный векторы  Пояснения в тексте

 Две векторные системы на основе Ti-плазмид.

А - бинарный, Б - коинтегративный векторы  Пояснения в тексте

Трансформация растительных клеток. Для трансформации растительных клеток был разработан ряд методов: использование Ti-плазмид, бомбардировка микрочастицами, использование векторов на основе вирусов, микроинъекции, электропорация и др. .

Методы введения ДНК в клетки растений

Как указывалось выше, такими способами были трансформированы более 50 различных видов растений. Однако в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяют агробактериальный (с помощью Тi-плазмид) и баллистический (бомбардировка микрочастицами) способы модификации растительного генома.

Использование агробактерий, содержащих клонирующий вектор, — достаточно высокоэффективная система, несмотря на то, что частота трансформации составляет 1 из 10000 растительных клеток. Кроме того, как уже отмечалось, они могут быть применены только для переноса генов в двудольные растения, Однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеница, кукуруза), практически не трансформируются A. tumefaciens. Поэтому для трансформации клеток однодольных чаще всего применяют баллистический способ. Для бомбардировки используют золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,5—2 мкм, покрытые ре-комбинантной ДНК. Этим частицам посредством электрического разряда или сжатым газом придается скорость 300—600 м/с, в результате чего они пробивают клеточную стенку и клеточную мембрану. Попав в клетку, рекомби-нантная ДНК интегрируется в растительную ДНК. Эффективность метода очень высокая — до 15%. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные. Ниже указаны трансгенные растения, полученные баллистическим способом:

Выделение трансформированных растений. Трансформированные тем или иным способом растительные клетки культивируют в условиях in vitro на специальных средах, способствующих регенерации из них растеньиц. Таким образом, из одной трансформированной клетки можно вырастить полноценное фертильное растение, все клетки которого несут чужеродную ДНК.

Культивирование регенерантов включает несколько серий пассажей («пересадок») на селективных средах, содержащих антибиотик или гербицид, благодаря чему клетки, в которых нет маркерного гена устойчивости к этим веществам, а следовательно, нет и чужеродной ДНК, погибают.

В дальнейшем с помощью определенных манипуляций добиваются элиминации (удаления) маркерных генов из геномов растеньиц-регенерантов, поскольку присутствие этих генов в культурах, использующихся в качестве сырья для производства продуктов питания, нежелательно.

Отобранные регенеранты используют для анализа геномной ДНК, который позволяет определить присутствие целевого гена и число его копий, интегрированных в геном.

Заключительный этап лабораторного тестирования ТГ-растений включает биологические исследования, определяющие стабильность проявления целевого признака.

Таким образом, с использованием описанных выше технологий к настоящему времени созданы и испытаны в полевых условиях ГМ-формы многих сельскохозяйственных растений. Так, получено значительное количество ТГ-форм томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, яблонь и др. Однако зарегистрировано и допущено к промышленному производству лишь незначительное количество ТГ-форм растений (например, в США — немногим более 100 линий ГМ-растений, в других странах — еще меньше). В России на сегодняшний день в государственном реестре зарегистрированы 17 видов продовольственного сырья из ГМИ и 5 видов ГММ. Это связано с тем, что прежде чем попасть на рынок, продукция, содержащая ГМ-компоненты, должна пройти экспертизу качества и безопасности.

Похожие статьи

znaytovar.ru

Как получают трансгенные растения

Биология Как получают трансгенные растения

просмотров - 122

Направления создания трансгенных растений

Сегодня при создании трансгенных растений преследуют такие цели:

- Повышение урожайности.

- Сокращение сроков вегетации и получение нескольких урожаев в год (в России созданы ремонтантные сорта клубники, дающие два урожая за лето).

- Приобретение растениями токсичности для некоторых видов вредителœей (в России созданы сорта картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок).

- Повышение устойчивости к неблагоприятным климатическим условиям (к примеру, к засухе путем переноса в геном растения гена скорпиона).

- Приобретение растениями способности синтезировать определœенные белки животного происхождения (к примеру, в Китае получен сорт табака, синтезирующий лактоферрин человека).

- Получение растений со свойствами «живых вакцин».

При достижении поставленных целœей биотехнология трансгенных растений позволяет решить комплекс агротехнических, продовольственных, технологических, фармакологических и других проблем.

Процесс получения трансгенных растений начинают с поиска крайне важного гена, который может находиться как в растительном, так и в животном организме. Поиском нужных генов занимаются многие лаборатории молекулярной генетики. Следующий шаг - выделœение нужного гена из чужой ДНК и его включение в молекулу ДНК нужного нам растения. Процесс данный наиболее сложен. Об операциях по пересадке гена написаны тома научной литературы. Но для того чтобы понять суть процесса, достаточно кратко рассмотреть процедуру переноса генов.

Тридцать лет назад были открыты специализированные ферменты рестриктазы, способные разделять длинную молекулу ДНК на отдельные участки – гены. Разрезанные рестриктазими фрагменты ДНК приобретают "липкие" концы, с помощью которых они способны встраиваться в разрезанную такими же рестриктазами чужую ДНК.

Распространенный способ внедрения чужих генов в наследственный аппарат растений основан на свойствах болезнетворной для растений бактерии Agrobacterium tumefaciens (в буквальном переводе с латыни - полевая бактерия, вызывающая опухоли). Эта бактерия умеет встраивать в хромосомы заражаемого растения часть своей ДНК, которая заставляет растение усилить производство гормонов, и в результате некоторые клетки бурно делятся, возникает опухоль. В опухоли бактерия находит для себя отличную питательную среду и размножается. Для генной инженерии специально выведен штамм агробактерии, лишенный способности вызывать опухоли, но сохранивший возможность вносить свою ДНК в растительную клетку (рис.1).

Нужный ген вклеивают с помощью ферментов рестриктаз в кольцевую молекулу ДНК бактерии, так называемую плазмиду. Эта же плазмида несет маркерный ген, к примеру ген устойчивости к антибиотику канамицину. Как правило, только небольшая доля операций по пересадке гена оказывается успешной. Те бактериальные клетки, которые включили в свой генетический аппарат "прооперированные" плазмиды, получают кроме нового полезного гена устойчивость к антибиотику. Их легко выявить, полив культуру бактерий антибиотиком, - всœе прочие клетки погибнут, а удачно получившие нужную плазмиду размножатся. Теперь этими бактериями заражают клетки, взятые, к примеру, из листа растения. Опять приходится провести отбор на устойчивость к антибиотику: выживут лишь те клетки, которые приобрели эту устойчивость от плазмид агробактерии, а значит, получили и нужный нам ген. Дальнейшую работу выполняют биологи, владеющие методами выращивания растений из отдельных клеток. Культивирование изолированных клеток растений и регенерация на их основе растений, способных самостоятельно размножаться, в последние годы получили широкое распространение.

Метод, основанный на использовании агробактерии, эффективен не во всœех случаях, к примеру, такие важные пищевые растения, как рис, пшеница, кукуруза, не восприимчивы к заражению агробактериями. Это привело к поиску новых способов переноса генов. Получены ферменты, растворяющие толстую оболочку растительной клетки, и вещества, к примеру полиэтиленгликоль, способствующие проникновению чужой ДНК в клетку.

Проницаемость клеточной мембраны можно увеличить, воздействуя на клетку короткими импульсами высокого напряжения (метод электропорации). Иногда применяют даже впрыскивание ДНК в клетку микрошприцем под контролем микроскопа. Хорошие результаты дал метод ДНК- пушки. Сверхмалые металлические "пули", к примеру шарики из вольфрама диаметром 1-2 микрона, покрывают подготовленными к переносу участками молекулы ДНК и "стреляют" из специальной пушки в растительные клетки. Проделываемые в стенке клетки отверстия быстро заживают, а "пули", застрявшие в протоплазме, так малы, что не мешают клетке функционировать. Часть "залпа" приносит успех: некоторые "пули" внедряют свою ДНК в нужное место.

Рис. 1. Два базовых метода создания трансгенных растений.

A – использование агробактерии;

Б - использование «ДНК-ПУШКИ»;

1 - введение ДНК в плазмиду бактерии;

2 - перенос ДНК в клетку растения;

3 - встраивание ДНК;

4 - размножение клеток с новым геном;

5 - получение целого растения и пересадка в почву;

6 - нанесение ДНК на металлические микрошарики;

7 - обстрел клетки шариками с частицами ДНК;

8 - растительная клетка

oplib.ru

Раздел 1. Получение и применения трансгенных растений

Раздел 1. Получение и применения трансгенных растений

При изучении данного раздела курса студент должен обратить внимание на феномен генетической колонизации растений бактериями рода Agrobacterium. Также необходимо уметьдатьструктурное и функциональное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов. Изучить принцип конструирования и характеристику промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті - плазмид. В данном пособии содержится материал по данным темам с рисунками 1-3 для более глубокого понимания.

В этом разделе студенту также необходимо освоить методы введения генетической информации в растения с помощью агробактерий, и возможности использования вирусов растений для создания векторных систем. Изучить такие методы как: трансформация, кокультивация, биобаллистика, электропорация, микроинъекций.

Растения обладают таким важным свойством, как тотипотентность, которое раскрывает для молекулярных биологов большие возможности по созданию трансгенных растений. Основной целью биотехнологических экспериментов на растениях является создание новых высокоурожайных сортов культурных растений без изменения их пищевой ценности. Исследования в этой области также направлены на обеспечение устойчивости растений к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, неблагоприятным условиям окружающей среды.

Феномен генетической колонизации растений бактериями рода Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей у двудольных растений. Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа «корончатого галла» коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки растений (рисунок 1). Трансформация является результатом включения сегмента («transferred» или Т-ДНК) плазмиды (pTi - tumor inducing или pRi — root inducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

1 - агробактерии существуют в ризосфере;

2 - строение A. tumefaciens;

3 - встраивание Т-ДНК в геном;

4 - образование опухоли.

Рисунок 1 – Генетическая колонизация растения A. tumefaciens

Структурное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов

В ходе исследований выявлено наследуемое изменение в клетках корончатых галлов — это синтез опинов. Необычное для растений соединение, производное аргинина, обнаруженное лишь в определенных опухолевых линиях, было названо октопином. Затем было показано, что другими опухолевыми линиями синтезируется еще одно соединение — нопалин, также производное аргинина. В зависимости от типа индуцируемого в опухоли опина штаммы A. tumefaciens и находящиеся в них Ti-плазмиды получили соответствующее обозначение — октопиновые или нопалиновые.

В результате исследований обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные области (А и D) вовлечены в онкогенность, еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды, в то время как последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса (рисунок 2). Кроме Т-ДНК в плазмидах имеется область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), а также область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir).

Рисунок 2 – Структура Тi-плазмид нопалинового и октопинового типа

Принцип конструирования и характеристика промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті- плазмид

Метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) служит для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение. Данный метод основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рисунок 3).

Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

 Рисунок 3 – Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды

Вопросы для управляемой самостоятельной работы:

1. Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, насекомым-вредителям, вирусам, стрессовым воздействиям, с измененным цветом лепестков цветка.

2. Перспективы создания трансгенных растений, устойчивых к бактериальным и грибковым заболеваниям, с улучшенными пищевыми качествами, товарным видом, пригодных для получения вакцин и сывороток из растительного материала.

3. Возможности использования трансгенных растений и качестве источников сырья для парфюмерной, химической и текстильной промышленности.

Вопросы для самоконтроля:

1. Что подразумевается под термином генетическая колонизация?

2. Какая бактерия несет инфекционный фактор, приводящий к болезни «корончатый галл»? Охарактеризуйте заболевание.

3. Какие практические задачи выполняют плазмиды бактерий?

4. Как осуществляется перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды?

6. Какие требования предъявляются к векторной молекуле?

7. Какие недостатки Ti – плазмид?

8. Охарактеризуйте коинтегративный клонирующий вектор.

9. Дайте определение понятию бинарный вектор.

10. Благодаря каким особенностям вироиды рассматриваются в качестве потенциальных векторов?

Литература: [1,2,3,4,6,8,9,10,11,12,13,14,15,16].

ebooks.grsu.by

Лекция 1 (15) - Лекция

Лекция 1. Генетическая инженерия как основа биотехнологии. Принципы получения трансгенных растений. Успехи и перспективы современной агробиотехнологии. Возможные риски.

В октябре 1999 г на Земле появился на свет 6-млрд-ный житель. В 1914 г. население земного шара составляло около 1,6 млрд чел, в 2025 г., по прогнозам, оно достигнет уже 8,3 млрд чел.

Причем, растительные продукты составляют 93% пищи человека, а остальные 7% составляют продукты животного происхождения, которые также образуются в результате потребления животными растительной пищи. Остро встает вопрос, как прокормить такую армию обитателей планеты?

Дальнейшее существенное увеличение урожая с/х культур на вряд ли может быть достигнуто за счет химизации, механизации и мелиорации сельского хозяйства. Использование этих подходов в последние десятки лет привело к значительному увеличению урожая, но одновременно и инициировало целый ряд экологических и экономических проблем, в частности, привело:

-к загрязнению окружающей среды

-к истощению энергетических ресурсов

-к возрастанию затрат на единицу произведенной продукции

Можно было бы рассчитывать повышать урожай за счет совершенствования классических методов генетики и селекции. Однако, следует сказать, что подходы традиционной генетики и селекции в отношении большинства с/х культур уже практически достигли своего предела.

В этих условиях необходим поиск новых путей, которые позволили бы повысить урожай основных с/х культур, улучшить его качество и снизить себестоимость продукции, не ухудшая при этом состояние окружающей среды. Решить эти проблемы и призвана зарождающаяся на наших глазах наука - биотехнология. По мнению лауреата Нобелевской премии Нормана Борлауга, "только новые развивающиеся биотехнологии могут спасти мир от голода экологических катастроф".

Биотехнология. Что это за наука?

Термин биотехнология был придуман в 1917 г. венгром Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы.

В широком смысле слова под биотехнологией понимают науку о применении биологических принципов, процессов и систем в сельскохозяйственном производстве и в промышленности (Акад. А.А. Баев).

Биотехнологию можно определить и как «применение научных и инженерных принципов к переработке материалов живыми организмами с целью создания продуктов и услуг».

Т.о., Биотехнология представляет собой органическое единство биологических, химических и инженерных дисциплин, разрабатывающих пути использования биологических организмов в с/х и промышленности.

Это определение носит очень широкий характер. Оно относится к таким древнейшим производствам как пивоварение, виноделие, хлебопечение и т.п. Использование живых организмов для получения нужных человеку продуктов питания имеет, как мы видим, историю протяженностью в несколько тысяч лет.

В конце 19 столетия использовали микробиологическую ферментацию для производства спирта, ацетона, уксусной кислоты и других химикатов.

В настоящее время культура микроорганизмов используется самым активным образом для получения антибиотиков и массы других коммерческих продуктов.

Что касается растений, то древний человек бессознательно занимался селекцией, отбирая растения со съедобными семенами и вкусными плодами, которые дают хороший урожай. Итогом этой деятельности явился огромный спектр видов важнейших сельскохозяйственных культур. Классическая селекция растений позволила получить новые лучшие культурные сорта.

Возникает вопрос, почему же человек занимается биотехнологией в течение всей своей истории, но только сейчас эта наука привлекла к себе всеобщее внимание?

Ответ на него очень прост - столь бурное развитие биотехнологии связано с революцией в области молекулярной биологии и клеточной инженерии. Создание рекомбинантных молекул ДНК позволило ликвидировать границы между далеко отстоящими друг от друга организмами и получить растения с такими комбинациями признаков, которые в природе были принципиально невозможны.

Биотехнология базируется на трех науках, на 3-х китах, благодаря интенсивному развитию которых она и приобрела сегодняшний облик. Речь идет о клеточной инженерии, молекулярной биологии и генетической инженерии.

Вас уже знакомили немного с клеточной инженерией. Я хочу сказать несколько слов о двух других науках.

Годом рождения молекулярной биологии является 1953 г. - год открытия Уотсоном и Криком двойной спирали ДНК, за что авторы были удостоены Нобелевской премии.

Молекулярная биология - это наука, изучающая структуру, свойства, взаимодействие и функции определенных видов макромолекул, прежде всего белков и нуклеиновых кислот.

Генетическая инженерия является преемником молекулярной биологии. Генетическую инженерию можно рассматривать как науку об изменении генетической программы клеток и о преодолении межвидовых барьеров.

Генетическая инженерия является и теорией и практикой современной молекулярной биотехнологии. Генетическая инженерия развивается очень стремительно.

Принято считать, что современная молекулярная биотехнология зародилась 12-13 лет назад и берет свое начало с 2-х событий:

Исторяи развития молекулярной биотехнологии

-1917 г. Карл Эреки ввел термин биотехнология

-1953 г. открытие двойной спирали ДНК

1966. расшифрован генетический код

1967 выделение ДНК-лигазы, фермента, ответственного за соединение 2-х различных фрагментов ДНК

1970. выделена первая рестриктаза

1973. Бойер и Коэн положили начало технологии рекомбинантных молекул

1976. Изданы первые руководства, регламентирующие правила работы с рекомбинантными ДНК

1976 создание первой биотехнологической фирмы под названием «Genentech»;

1976. фирма “Genentech” выпустила человеческий инсулин, полученный с помощью E. coli

1981. Поступили в продажу первые синтезаторы ДНК

1982. Разрешена к применению первая вакцина, полученная с помощью технологии реколбинантной ДНК

1983. Для трансформации растений применена Ti-плазмида

1988. Создан метод ПЦР

1989. Начаты работы над проектом «Геном человека»

1996 Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил миллиард долларов

В настоящее время количество биотехнологических фирм исчисляется не сотнями, а тысячами.

О современном состоянии агробиотехнологии мы будем говорить несколько позже, а сейчас очень кратко рассмотрим принципы получения рекомбинантных ДНК и трансгенных растений.

Получение рекомбинантных ДНК как ключевой метод современной молекулярной биотехнологии

Рекомбинантная ДНК представляет собой химерную ДНК, состоящую из фрагментов ДНК различного происхождения.

Образование рекомбинантной ДНК это широко распространенное в природе явление. Однако в природе рекомбинация имеет место:

• - in vivo между молекулами ДНК, обладающими высокой степенью гомологии

• эти молекулы должны находиться внутри одной клетки.

Это означает, что рекомбинация в природе имеет место только между близко родственными видами.

Новая рекомбинантная технология:

• осуществляется in vitro

• возможна между любыми фрагментами ДНК из любых биологических организмов

Это означает, что генетическая инженерия позволяет преодолевать генетические барьеры и рекомбинировать ДНК из абсолютно различных организмов.

Более того, селекция специфических последовательностей ДНК, или генов, для вставки внутрь хозяйской ДНК является как более быстрой, так и потенциально более эффективной, чем методы традиционной селекции.

Обычно при получении трансгенных растений говорят о конструировании или инженерии растений, поскольку чужой ген вводится внутрь генома искусственным путем.

Принципы технологии генетической инженерии представлены на рисунке

.

Технология получения трансгенных растений включает 3 принципиальных момента:

1. Поиск и выделение чужеродной ДНК, содержащий нужный нам ген

2. Создание вектора, т.е. такой конструкции, которая обеспечивает экспрессию (работу) нужного нам чужеродного гена

3. Наличие способа введения вектора внутрь растения-хозяина

Существуют по меньшей мере 3 подхода для изоляции генов или получения их копий:

1) Выделяют ДНК из растения и фрагмент ДНК с интересующим геном подвергают рестрикции (т.е. вырезанию) с помощью ферментов, т.н. рестриктаз (или рестрикционных эндонуклеаз).

Рестриктазы - это ферменты бактерий, которые узнают и разрезают ДНК в специфических последовательностях, состоящих из 4-8 нуклеотидов. Эти ферменты разрезают ДНК, как правило, на много фрагментов, т.к. рестриктазы имеют большое число сайтов рестрикции в целом геноме. Многие из полученных рестриктов будум содержать только часть гена или области, которые не могут нормально экспрессироваться. Однако различные виды бактерий продуцируют много различных ферментов рестрикции с различной спецификой, поэтому всегда можно найти фермент, который позволит вырезать фрагмент ДНК с интересующим нас геном. Этот способ позволяет получить фрагмент ДНК, содержащий реальный ген.

2. Получение кДНКовой копии гена

В данном случае выделяют из растения не ДНК, а фракцию мРНК, которую и используют для прямого синтеза копии нужного нам гена. кДНК синтезируется на мРНК ферментом, который использует мРНК как матрицу.Этот фермент называется обратной рестриктазой или ревертазой. Обратите внимание, что в данном случае информация передается от мРНК к ДНК, а не наоборот, как требует того основная догма молекулярной биологии, утверждающая, что всегда информация передается по цепочке ДНК-РНК-Белок.

3) Синтез нужной последовательности ДНК (гена) с помощью ПЦР

Следующий шаг - вставка нужной ДНК в вектор, который в целом представляет собой небольшой кольцевой фрагмент двунитевой бактериальной ДНК и обычно носит название плазмиды. Существенно, что плазмида разрезается той же самой рестриктазой, что и вырезается интересующий нас ген. Это позволяет получить т.н. «липкие концы» ДНК, т.е. комплементарные последовательности ДНК на концах фрагмента и плазмиды. За счет комплементарности происходит взаимодействие концов чужеродного фраглента ДНК (нашего гена) с концами плазмиды. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида, содержащая чужеродынй ген, может быть вставлена в клетку хозяина.

Наиболее широко используемый вектор для введения чужеродный генов в растения - Ti-плазмида бактерии Agrobacterium tumifacience, вызывающая опухоль корончатого галла. Эта бактерия является природным генным инженером, поскольку она может передавать в инфицированное растение Ti-плазмиду, которая содержит информацию для перерождения (трансформации) нормальной ткани в опухолевую. Эта информация локализована во фрагменте, получившем название Т-ДНК. Именно эта область плазмиды в норме передается в геном растения-хозяина во время инфекции.

Для использования Ti-плазмиды в качестве вектораиз из нее удаляют область, ответственную за опухолевое перерождение ткани, ту самую Т-ДНК и заменяют ее на нужный нам чужеродный ген, который должен быть клонирован. Эта операция делает бактерию авирулентной, но не лишает ее способности инфицировать и трансформировать клетки хозяина.

Векторная плазмида также содержит ген устойчивости к антибиотику (обычно, к канамицину), который позволяет легко селектировать, т.е. отбирать трансформированные растения, содержащие чужеродный ген.

Трасформация растений Agrobacterium может быть осуществлена ее совместным культивированием с протопластами или инфицированием листовых дисков. В первом случае будет иметь место инокуляция протопластов бактерией, содержащей рекомбинантную плазмиду. После 2-3 дней культивирования бактерия убивается с помощью антибиотика, и протопласты превращаются в микрокаллус. Микрокаллус далее переносится на среду с канамицином. В этих условиях выживут только те клетки, которые трасформированы рекомбинантной плазмидой, содержащей как ген устойчивости к канамицину, так и чужеродный ген.

При втором способе трансформации маленькие диски из стерильного листа (или другой ткани) могут быть инкубированы с Agrobacterium, что позволит инфицировать их бактерией на местах среза. Бактерии после этого убиваются, а клетки подвергаются селекции на среде с канамицином.

В обоих случаях - последняя стадия заключается в создании гормонального баланса в среде культивирования, который способствует регенерации растений.

Результатом является трансформированное растение, которое экспрессирует новый чужеродный ген, и этот ген наследуется генетическим способом.

Недостатком Agrobacterium как трансформирующего вектора является ограниченный спектр хозяев. Этот способ эффективен для двудольных, хотя есть сообщение об успешной трансформации этим вектором и однодольных растений.

Существуют методы и прямого переноса генов в клетки и ткани:

1. Компетентность клеток поглощать ДНК может быть инициирована их инкубацией с ПЭГ или электропорацией.

2. Существует способ трансформации путем микроинъекции ДНК прямо в протопласты или с помощью т.н. электронной пушки. В последнем случае частицы, обернутые в плазмидную ДНК, ускоряются до огромных скоростей. Это позволяет им пробивать клеточную стенку ипроникать внутрь клетки.

Привести примеры получения трансгенных растений.

1) Получения трансгенных растений устойчивых к листогрызущим насекомым. В качестве примера можно кратко рассмотреть технологию получения устойчивых к насекомым растений хлопчсатника.

Фирма Монсанто. Перенос в растения гена Bt-токсина из одной из бацилл. Механизм действия этого токсина. Желательность суперэкспрессии этого гена в растении.

2) Получение устойчивых к гербицидам растений. Нам всем хорошо известно, что без гербицидов сегодня немыслимо интенсивное земледелие.

В этой области химия не имеет конкурентов. Она производит их на 15 млн $. Однако химия не только решает свои проблемы, но и создает новые (высокая стоимость пестицидов, токсичность, мутагенность, тератогенность, вред для окружающей среды).

Существенным недостатком является снижение эффективности действия используемых химикатов. Так, с 1948 г до 1980 г число видов насекомых, резистентных к пестицидам возросло с 14 до 429.

Одновременно возрастает число видов растений, резистентных к самым популярным гербицидам. Только к группе триазиновых гербицидов обнаружено 57 видов, а всего число устойчивых к гербицидам видов растений превышает 120.

По данным одной из американских фирм, в 50-е годы из 1800 соединений получало выход на рынок лишь одно. В настоящее время лишь 1 из 12000 соединений попадает на рынок. Между тем стоимость разработок достигла 25 млн $ на 1 препарат. Сейчас в мире производят 200000 химических соединений в год.

Очень распространенными являются гербициды, действующие на метаболические пути фотосинтеза или синтеза аминокислот, однако они токсичны не только для сорняков, но и для культурных растений. Идеальный гербицид должен быть лишен этого недостатка.

Создание безвредных пестицидов начинается

1. с идентификации звена метаболической цепи, на которое данный гербицид действует.

2. Затем следует создание гена, кодирующего резистентность к гербициду, и трансформация этим геном культурного растения. Т.е. в данном случае используется логика не классической, а «обращенной» генетики, где движение идет не от фенотипа к гену, а в противоположном направлении.

В качестве примера я коснусь устойчивости растений к гербициду атразину и симазину. Оба гербицида ингибируют траспорт электронов, связываясь с белком 32 кД Д1, локализованным во второй фотосистеме. Устойчивость к этому гербициду достигается 2 путями:

1. В корнях кукурузы, сорго и ряда сорняков имеется фермент глютатион-S-трансфераза, который быстро детоксифицирует гербицид, образуя его коньюгат с глютатионом.

2. Генноинженерным путем также получили устойчивость к данному гербициду. Было показано, что введение лишь одной точечной мутации в ген белка 32 кДа Д1, которая приводит к-замене серина на глицин, а это сопровождается снижением на 3 порядка степени связывания белка с гербицидом. Это фактически означает, что полученные таким путем трансгенные растения абсолютно устойчивы к атразину.

В настоящее время получено много трансгенных культурных растений, резистентных к другим классам гербицидов.

Примерно такова принципиальная технология получения любых трансгенных растений.

Успехи и перспективы биотехнологии

Нет сомнения, что XXI век будет веком трансгенных растений. Трансгенные сорта, устойчивые к пестицидам, вирусам, насекомым и др. негативным воздействиям, очень быстро вытесняют старые сорта, а в США и Канаде начинают доминировать среди ряда с/х культур. Международная служба по применению агробиотехнологий приводит следующую динамику распространения трансгенных растений:

1996 - 1,7 1997 - 11,0 1998 - 27,8 га

В США трансгенные культуры занимали 20,5 млн га

В Аргентине 4,3

В Канаде 2,8

В Китай

Основными трансгенными культурами являлись в 1998 г соя, кукуруза, хлопчатник, рапс, картофель.

Трансгенным растениям придавали следующие основные признаки:

1. устойчивость к гербицидам (70%)

2. Устойчивость к насекомым (28% - гены Bt-токсина)

3. На последнем месте находились признаки качества продукции

Появились трансгены, несущие уже по 2 признака (н-р, в 1998 г. в США зарегистрирован картофель, обладающий устойчивостью к колорадскому жуку и к основным вирусам картофеля). За 1 год площади, занятые такими культурами возросли в 10 раз.

Рост площадей под трансгенными культурами в развитых странах идет в 5 раз интенсивнее, чем в развивающихся.

Соя занимает 1-е место среди трансгенных культур (56%) по темпу прироста площадей. За ней следует кукуруза (30%), рапс (7) и хлопчатник (6%).

В 1998 г. резко увеличились площади под гербицидоустойчивой соей:

в США с 3,6 млн га в 1997 г до 10,2 в 1998 г., что составляет 36% всех площадей, занятых под соей. В Аргентине с 1,4 млн га в 1997 г до 4,3 в 1998 (55% всей площади под соей).

Под кукурузой, устойчивой к кукурузному пилильщику, площади выросли с 2,8 млн га в 1997 г до 6,5 в 1998 (22% всей площади под этой культурой в США).

Что же происходит в Европе?

Только в апреле 1998 г Европейский союз рекомендовал использование трансгенных сортов. Однако уже в этом 1998 г. в Испании на площади 20 тыс га и во Франции на 2 тыс га была высеяна устойчивая к кукурузному пилильщику кукуруза. Далее был объявлен мораторий на ГМО, который в настоящее время еще не отменен.

Какова же прибыль от трансгенных культур?

США: 1996 г. - общая прибыль 92 млн $ (61 млн при выращивании устойчивого к хлопковой сойку хлопчатника, 19 млн - за сою, устойчивую к гербициду Раундап.

1997 г. - общая прибыль 315 млн $ (от трансгенной кукурузы - 119 млн, от трансгенной сои - 109 млн, от трансгенного хлопчатника - 86 млн, от картофеля, устойчивого к колорадскому жуку - 1 млн).

В КАНАДЕ: общая прибыль в 1996 г. 5 млн $ (трансгенный рапс), 53 млн $ в 1997 г (в т.ч. за счет устойчивой к кукурузному пилильщику кукурузы).

Мировые продажи трансгенных культур

1995 г - 75 млн $, 1996 - 235 млн, 1997 - 670 млн, 1998 - 1,2-1,5 млрд $.

По прогнозам продажа трансгенных культур в мире составит 2 млрд долл. в 2000 г., 6 млрд долл - в 2005 г и 20 млрд долл - в 2010 г.

В соответствии с прогнозом газеты «Эксперт» (от 8 июня 1998 г), через 10 лет мировой объем продаж биотехнологических продуктов только с\х назначения составит более 300 млрд $.

Число стран, выращивающих трансгенные культуры

1992 г. - 1 страна, 1996 - 6 стран, 1998 - 9 стран, 2000 - 20-25 стран.

Каковы же цели получения трансгенных растений?

Помимо повышения устойчивости растений к гербицидам как таковой появилась еще 1 возможность использования генов устойчивости к гербицидам - борьба с растениями-паразитами. Намачивание семян гербицидоустойчивых сортов в растворе гербицида или обработка его раствором проростков сопровождается торможением роста и ингибированием прорастания семян растений-паразитов (н-р, заразихи), но не культурных сортов с/х растений.

В самое последнее время появляются сорта трансгенных растений, сочетающие устойчивость к вредителям, гербицидам и болезням с повышением качества продукции за счет увеличения доли незаменимых АК в белках, увеличения содержания белков, жиров и углеводов, способные храниться более длительный срок без ухудшения качества.

Очень перспективным представляется создание трансгенных растений, несущих гены, кодирующие синтез вакцин против различных болезней человека. Поедание сырых овощей и фруктов, содержащих белки вакцин, обеспечивает оральную вакцинацию. Причем этот путь получения вакцин является фантастически дешевым по сравнению с тпрадиционными путями их получения. В настоящее время получены растения трансгенного картофеля, которые синтезируют сыворотку против вируса, вызывающего эпидемический гастроэнтерит у человека.

Получены, по первой информации, также растения картофеля, способные производить белки сыворотки против энтеротоксина холеры.

Используются новые подходы для получения устойчивых к заболеваниям растений. Установлено, что все растения, особенно прорастающие семена, содержат небольшие пептиды (45-54 АК, богатые цистеином), т.н. дефензины Трансгенные растения табака с геном дефензина редьки под 35S промотором характеризовались снижением в 7 раз размера пятен, вызываемых инфекцией патогена Alternaria solani.

Оригинальным является использование антибактериального пептида саркотоксина 1А мясной мухи для получения трансгенных растений табака с повышенной устойчивостью к ряду патогенов.

Создаются трансгенные растения, обладающие способностью конститутивно синтезировать элиситоры, что обеспечивает повышенную устойчивость растений, н-р, к Pseudomonas.

Качество зерна злаков (н-р, кукурузы) сильно снижается при поражении патогенными грибами такими как Fusarium. Эти грибы синтезируют т.н фумонизины, которые являются токсичными, придающими зерну плохой вкус и запах. Фирма "Пионер" начала клонировать ферменты деградации фумонизинов, что предотвратит падение качества семян при поражении их грибами.

Китайские биотехнологи создали полностью синтетические гены для защиты растений от бактериальных болезней. На основании анализа структуры и функции 12 естественных антибактериальных пептидов против вилта картофеля, они синтезировали 3 новые полипептида, обладающих предположительно более высокой защитной функцией.

Наметился прорыв в генетике минерального питания.

Выделен ген, отвечающий за транспорт фосфатов в растениях арабидопсиса и томатов. Этот ген активно экспрессируется при снижении содержания фосфатов в питательном растворе. Пытаются получить трансгенные растения, способные более эффективно поглощать фосфор.

Усиление транспорта нитратов в растениях.

Ген CHL1 арабидопсиса контролирует транспорт нитратов и влияет на их поглощение корнями из почвы. Трансгенные растения арабидопсиса с геном CHL1 обладали повышенной способностью поглощать нитрат. Растения риса с несколькими негами транспорта нитрата из арабидопсиса также более эффективно поглощали нитрат.

Появились первые сообщения о получении устойчивых к холоду растений. Эти растения заставили активно и конститутивно экспрессировать ген, кодирующий фактор транскрипции CBF-1, регулирующий работу многих COR-генов, которые включаются в ответ на понижение температуры. Полученные тарнсгенные растения обладали повышенной устойчивостью к низким повреждающим температурам.

Большое внимание исследователей привлекает получению растений, устойчивых к активированному кислороду или к свободным радикалам кислорода, которые образуются при протекании физиологических процессов особенно в условиях стресса. Система инактивации свободных радикалов кислорода очень сложна, одним из ее компонентов является SOD. В настоящее время получены ряд растений содержащих чужеродный ген SOD. Н-р, растения люцерны активно экспрессировали этот ген, обладая при этом повышенной устойчивостью к гербициду акирфторфену и повышенной регенерационной способностью после повреждения заморазками.

Получение стресс-толерантных (т.е. устойчивых не к 1, а ко многим повреждающим воздействиям) растений (комментарии)

Разработан новый подход для получения бессемянных плодов и овощей в дополнение к уже имеющимся апельсинам и винограду, основанный на экспрессии гена iaam Pseudomonas, кодирующего фермент синтеза ауксина. Если этот ген подставить под промотор гена DefH9 львинного зева, который экспрессируется только в клетках семяпочек, у образовавшихся трансгенных растений табака в неоплодотворенных семяпочках синтезируется ауксин, что имитирует возрастание его уровня в семяпочках после оплодотворения. В сформировавшихся плодах баклажана отсутствовали семена. Причем в этом случае бессемянные плоды завязывались при низких температурах и неблагоприятном фотопериоде, когда в контроле образования плодов не происходило.

Использование трансгенных растений может быть сопряжено с определенными проблемами экологического и даже общебиологического характера, в частности с представляет угрозу обмен генов между сконструированными трансгенными растениями и родственными им культурными и дикими видами. Одним из подходов для решения этой проблемы является создание семян, обладающих мужской стерильностью.

Альтернативным подходом является внесение желаемых генов в хлоропластный геном. Для большинства видов культурных растений хлоропласты наследуются строго по материнской линии и т.о. трансгены не будут передаваться с пыльцой.

Одним из преимуществ внесения генов в хлоропластный геном является очень высокий уровень экспрессии трансдуцированных генов, что связано с большим количеством копий хлоропластного генома в клетке (5000-10000) и высокой эффективностью работы аппаратов транскрипции и трансляции пнри внесении прокариотических генов в прокариотический по природе хлоропластный геном.

По данным Малиги и др , введенные в хлоропласты трансгены экспрессировались весьма активно. При трансформации гена cry1A (с) из Bacillus его экспрессия достигала 3-5% от растворимого белка листье табака (это очень высокий процент). При самоопылении этих растений и проращивании полученных семян на среде с гербицидом все прорастающие растения были гомопластичны, т.е. имле только трансформированные хлоропласты.

Одним из новейших направлений использования трансгенных растений является их применение для фиторемедитации - т.е. очистки почв, грунтовых вод от загрязнений - тяжелых металлов, радионуклидов и т.п. Задача заключается в том, чтобы научить растения аккумулировать максимальное количество ТМ или радионуклидов в листьях или в корнях, что и позволит очищать окружающую среду. Задача может быть и иной - получение растений - не аккумулирующих загрязняющие агенты в тех органнах, которые используются человеком в пищу. Например, салат леттук и табак накапливают кадмий в основном в листьях, тогда как другие растения - в корнях.

Для создания подобных растений пытаются использовать фитохелатины - маленькие пептиды, которые используются в растительном мире для связывания и, т.о. для инактивации ТМ. Другим подходом может быть использование генов металлотионеинов - богатых цистеином белков, также способных связывать ТМ. В настоящее время получены трансгены, содержащие лишь ген металлотионеина, но не фитохелатинов.

Для интоксикации ртути, получены трансгенные растения табака, рапса, тополя и арабидопсиса, которые способны аккумулировать до 80% ионов ртути в условиях гидропонной культуры. Для этого использовали ген merA устойчивой к ртути бактерии, кодирующих белок переноса и детоксикации ртути. Полученные трансгенные растения не обнаруживали ингибирования ртутью роста или метаболизма, т.е. имели повышенную устойчивость к этому токсичному металлу.

Растения и паутина.

Дебабов В.Г. и ИФР РАН

Как должен работать чужеродный ген - конститутивно или индуцибельно?

Во многих случаях вынгодно, чтобы ген обладал не конститутивной экспрессией, а индуцибельной, т.е. включался только в определенное время, на определенной стадии развития, в требуем органе или ткани. Для решения этой проблемы предложена экспрессия генов, индуцируемая химическими соединениями. В качестве генов, индуцируемых химическимим соединениями, был выбран промотор alc Aspergillus. Получены трансгенные растения рапса, табака и томатов, у которых репортерные гены CAT и GUS экспрессировались под промотором alcA, содержащих сайты активации транскрипции ALCR. Эти репортерные гены активировались через 4 час при низких концентрациях этанола. Могут быть созданы генноинженерные конструкции, которые будут активироваться в ответ на световую обработку, на повышение, или, напротив, на понижение температуры.

refdb.ru

• 
  Растение бузина черная фото
• 
  Полезные растения на даче
• 
  Паспорт растения китайская роза
• 
  Комнатные растения клеродендрум уход
• 
  Маракумба растение что это
• 
  Растения хосты в саду
• 
  Магические растения седир поль
• 
  Эм препараты для растений
• 
  Растения опыляемые насекомыми имеют
• 
  Растение зверобой полезные свойства
• 
  Комнатные растения хлорофитум уход