Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот. Выделение днк из растений
Выделение ДНК
Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) представляют собой универсальный источник информации по всем генетическим признакам любого вида.
Впервые воссоздать модель двухцепочечной ДНК и обосновать ее удалось ученым Френсису Крику и Дж. Уотсону в 1953 году. Пространственная структура ДНК, представляющая собой две спирали, состоит из единиц – нуклеотидов, она является индивидуальным признаком каждого вида.
В современном мире представляется возможным выделение ДНК из абсолютно любого доступного биологического материала, состоящего из клеток, имеющих, кроме прочего, в своем строении оформленное ядро. Это так называемые клетки-эукариоты. К ним относятся клетки животных, растений, вирусов или микроорганизмов. При выделении ДНК человека, как правило, используется кровь, а именно лейкоциты. Также представляется возможным экстрагировать ДНК из мышечной ткани, фекалий, спермы, ногтей, волос и других образцов. Кроме того, для анализа на ДНК подходят окурки, почтовые марки, жвачки – одним словом все то, где могла остаться слюна человека, у которого берут анализ.
Поступенчатое описание процесса выделения ДНК, возможные методы, используемые при этом.
Весь процесс экстракции ДНК состоит из цепочки последовательных, связанных друг с другом этапов:
Набор для выделения ДНК1. Быстрое разрушение клеток (лизис).
2. Освобождение рабочего материала от клеточного содержимого (органелл) и мембран.
3. Денатурация белков, их экстрагирование с помощью ферментов.
4. Извлечение искомых нитей ДНК, взаимодействие их с этиловым спиртом с целью выделения осадка.
5. Растворение полученной твердой фазы в буферной жидкости.
Методов выделения ДНК существует множество. Вот некоторые из них:
* Экстракция под действием органических растворителей;
* Экстракция с помощью гель-фильтрации;
* Экстракция с помощью магнитных частиц;
* Экстракция на бумажных фильтрах;
* Ионообменные смолы.
Это далеко не полный перечень доступных сегодня методов выделения ДНК. Выбор способа экстракции зависит от вида и степени очистки исследуемого образца, от поставленной задачи и времени, планируемого для ее выполнения.
Выбор метода выделения ДНК, требования к материалам и условиям его хранения.
Процесс выбора наиболее подходящей методики выделения ДНК сопряжен с оценкой нескольких критериев:
* Вид первичного материала (ткани, листья, семена растений, образцы животного происхождения, продукты переработки и прочее).
* Вид источника нуклеиновых кислот.
* Характеристики ожидаемого результата (время, затраченное на анализ, степень очистки, ее продолжительность, выход исследуемого образца).
* Будут ли нуклеиновые кислоты исследуемого материала использоваться далее (для клонирования, ПЦР, синтеза кДНК).
Существую также особые правила для хранения и транспортировки исследуемых образцов материала:
* Если для анализа берут кровь, то она должна быть охлаждена. При этом важно избегать замораживания.
* Анализ образцов проводится в течение 2-х суток. Если провести экстракцию в этом временном диапазоне не представляется возможным, то исследуемые материалы подвергают криозаморозке при температуре от -20⁰С до -80⁰С.
* Важно не допускать повторные заморозки и оттаивания образца по причине того, что эти процессы негативно сказываются на структуре самой ДНК, может нарушаться ее целостность. Итогом это может стать затруднение и затягивание анализа, либо его полная невозможность.
* Недопустим процесс загрязнения исследуемых образцов.
Значение экстракции ДНК для современной жизни
Выделение ДНК с развитием прогресса, в том числе с точки зрения генно-молекулярной инженерии, перед человеком открываются новые горизонты для исследований и возможности для внедрения результата этих опытов в повседневную жизнь.
Так, например, вместе с умением выделять ДНК практически из всех биологических жидкостей и тканей организма человека, пришла способность устанавливать, научно доказывать наличие или отсутствие близкородственных связей между людьми. Особенно широко это применяется в судебной практике для установления отцовства.
Также ДНК-идентификация личности нашла свое применение в криминалистике, являясь подчас единственным доказательством причастности или же непричастности подозреваемого к преступлению.
В области диагностики различных заболеваний также широко применяются ДНК-технологии. Они позволяют вовремя выявить, а также по возможности скорректировать различные отклонения от нормы при развитии некоторых патологий (например, серповидная анемия, муковисцидоз). Огромное значение это имеет в гинекологии при планировании беременности и на стадии вынашивания плода, особенно, если ранее, за несколько поколений, в роду имели место какие-либо генетические и соматические отклонения.
Посредством ДНК-технологий разрабатываются некоторые лекарственные препараты (например, вакцина против вирусного гепатита В, гормон роста, инсулины). С помощью генной терапии появилась возможность внедрения в организм больного полноценных здоровых генов взамен мутировавших, таким образом, восстанавливая полноценную работу органов и устраняя соматические нарушения. В педиатрии такое лечение используется при терапии врожденных иммунодефицитов.
ДНК-технологии обширно применяются в сельском хозяйстве, например, для селекции растений. Эти методы призваны создавать такие сорта сельхозугодий, которые будут максимально идеальными по пищевой ценности, внешним характеристикам, способности противостоять воздействиям окружающей среды, неприхотливости к условиям хранения и транспортировки.
В современном мире развитие новейших технологий идет быстрыми темпами. Осваиваются все новые направления для использования генной инженерии и ДНК-методов в повседневной жизни. «Клонирование», «Генная селекция», «Генно-модифицированные продукты» — эти слова далеко не новые в лексиконе современного человека.
testdnk.pro
Лаборатория на кухне (выделение в домашних условиях ДНК)
Одной из основных задач генной инженерии является получение белков с заранее заданными свойствами. Для решения этой задачи необходимо уметь направленно изменять мельчайшие составные части генов – отдельные пары нуклеотидов молекулы ДНК. Такие операции c самой большой молекулой стали возможными сравнительно недавно и связываются в сознании обычного человека с ультрасовременными лабораториями, оборудованными сложными и дорогими приборами. Читая о современных достижениях генной инженерии, наверное, мало кто предполагает, что выделить и потрогать довольно чистый препарат «святая святых» жизни – ДНК – можно не только в специальных лабораториях, но и в домашних условиях. Экспериментируя, вы сможете усовершенствовать и изменить предлагаемые процедуры и узнать много нового об одном из важнейших компонентов клетки.
Нативная цепь молекулы ДНК может содержать несколько миллионов атомов. В водном растворе цепи ДНК несут слабый отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга. Если в растворе в достаточном количестве присутствуют положительно заряженные ионы, они притягиваются к цепям ДНК и нейтрализуют их заряд, в результате чего цепи ДНК могут слипаться. Таким образом, изменяя концентрацию соли, можно заставить отдельные фрагменты ДНК диссоциировать или, наоборот, объединяться. Это явление и лежит в основе методов выделения ДНК из клеток.
Почти все необходимое для выделения ДНК вы сможете найти на кухне. Сначала надо приготовить буферный раствор (буфер). Налейте 120 мл воды в чистую стеклянную емкость, добавьте 1,5 г (1/4 чайной ложки) поваренной соли, 5 г (1 чайную ложку) питьевой соды. В буфер надо добавить немного детергента – 5 мл (1 чайную ложку) шампуня или жидкого средства для стирки. Можно попробовать какие-нибудь другие детергенты, например средства для мытья посуды, но туалетное мыло лучше не использовать, т.к. в нем содержится большое количество добавок. Детергент выполняет две функции: разрушает клеточные стенки и способствует расщеплению крупных белков, которые иначе могут выделиться вместе с ДНК. Для того чтобы замедлить деградацию выделенной ДНК, буфер перед началом опыта охлаждают в кастрюле или любом другом сосуде, наполненном смесью колотого льда с солью.
Для приготовления буфера лучше использовать очищенную поваренную соль и дистиллированную воду, но подойдут также йодированная соль и покупная вода в бутылках или фильтрованная вода. Водопроводную воду из-под крана лучше не использовать.
В качестве источника ДНК подойдут овощи или фрукты. Хорошие результаты получаются с луком, чесноком, бананами и томатами. Но вы можете попробовать какой-нибудь другой фрукт или овощ. Возьмите его, разрежьте на мелкие кусочки, поместите в подходящий по размерам чистый сосуд, добавьте немного воды и тщательно измельчите до однородного состояния миксером с ножами (блендером), включая его несколько раз на 10 с с небольшими перерывами. Если нет миксера, можно использовать давилку для чеснока. При такой обработке клетки отделяются друг от друга, что способствует более эффективному действию детергента.
Поместите 5 мл полученного пюре в чистую емкость, добавьте 10 мл охлажденного буфера. Полученную смесь энергично перемешивайте в течение не менее 2 мин – в это время происходит разрушение клеточных стенок детергентом и выход содержимого клеток в раствор. Далее нужно отделить раствор, содержащий ДНК и другие молекулы, от нерастворимых остатков растительного материала. Для этого лучше всего использовать центрифугу (сепаратор): смесь прокрутите на центрифуге на низкой скорости в течение 5 мин, а затем, стараясь не взбалтывать осадок, слейте в длинный узкий сосуд (например, в пробирку, прозрачный пузырек из-под лекарств и т.п.) не менее 5 мл надосадочной жидкости.
Если у вас нет центрифуги, можно отфильтровать раствор через обычный кофейный фильтр или полотно. Если вам повезет, крупные частицы, все-таки прошедшие через фильтр, либо осядут на дно, либо будут плавать на поверхности. Для получения чистого раствора слейте его верхний слой, подождите, пока осядут остальные частицы, и затем аккуратно слейте (или перенесите пипеткой) жидкость в узкий сосуд.
Полученный раствор содержит фрагменты ДНК и множество других молекул – РНК, белков, углеводов и т.п.
Для экстракции ДНК необходимо небольшое количество изопропилового спирта (изопропанола, ИПС), предварительно сильно охлажденного в морозильнике. Используйте чистый изопропанол (без красителей и отдушек) в самой высокой концентрации, какую только удастся достать (обычно его продают в концентрации не ниже 70%). При помощи соломинки для коктейлей аккуратно нанесите 10 мл охлажденного спирта на поверхность раствора ДНК. Для этого погрузите соломинку в сосуд со спиртом и зажмите верхнее отверстие, затем опустите нижний конец соломинки в пробирку с раствором, прикоснитесь соломинкой к стенке и, слегка наклонив пробирку, позвольте спирту медленно стечь по стенке. Не набирайте спирт в трубочку (или пипетку) ртом! Если вы все сделали правильно, спирт, плотность которого меньше плотности буфера, останется на поверхности раствора.
Поместите тонкую стеклянную или деревянную палочку, например карандаш, в раствор таким образом, чтобы ее кончик оказался непосредственно под границей между буфером и спиртом, и очень осторожно в течение 1 мин поворачивайте попеременно в разные стороны. При этом наиболее длинные фрагменты ДНК накрутятся на палочку. Затем вытащите палочку – спирт заставит ДНК прилипнуть к концу палочки, и вы увидите на нем прозрачный вязкий осадок.
Конечно, в результате этой простой процедуры нельзя получить чистый препарат ДНК. В лаборатории в буфер добавляют ферменты, разрушающие млекулы РНК, которые иначе могут выделиться вместе с ДНК.
Даже после самой тщательной экстракции часть ДНК останется в растворе, образуя в нем невидимую паутину. При небольших дополнительных усилиях этот материал тоже можно увидеть. Некоторые красители, например метиленовый синий, связываются с заряженными фрагментами ДНК. Для окраски нитей, образованных оставшейся в растворе ДНК, достаточно добавить в него микроскопическое количество красителя – его молекулы свяжутся с ДНК, оставляя раствор неокрашенным. Возможно, для этой цели подойдут какие-либо пищевые красители или краски для тканей или волос – экспериментируйте!
По материаламScientific American,сентябрь, 1998
Разработка внеурочного занятия по теме "Выделение ДНК из растений"
Тема: Введение в образовательную программу «Юный исследователь».
Цель: сформировать у детей первичный интерес к исследовательской и проектной деятельности.
Задачи:
Образовательная: познакомится с приемами исследовательской деятельности на примере изучения роли ДНК в клетке, организме и её выделения из клеток растений;
научить детей совместно с педагогом элементам выполнения исследовательской работы «Выделение ДНК».
Развивающая: формирование приемов, умений и навыков по организации исследовательской деятельности при проведении опытов.
Воспитательная: формирование у детей положительной мотивации к их исследовательской деятельности;
формирование позитивной самооценки, самоуважения.
Условия проведения, оборудование:
Учебный кабинет на 10 детей с двумя зонами:
рабочее место с ПК, для педагога;
2 стола для работы детей в группах по 5 человек.
Лабораторное оборудование для опытов (колба, мерный стакан, прозрачная чашка, блендер, пластиковые емкости, скальпель, ложки, марля).
Лабораторные материалы для опытов (луковица, банан, спирт, средство для мытья посуды, вода фильтрованная, соль).
Средства обучения:
Технические:
ПК (1 рабочее место для педагога), медиапроектор, экран.
Дидактические:
руководство для проведения опыта;
бланк для выполнения творческого задания «Исследование»;
листы для записи пожеланий;
файл презентации педагога.
Описание занятия.
Работая в малых группах, дети принимают участие в практической работе по выделению ДНК из растений.
Предпочтительный возраст детей для вхождения в программу -11 лет.
Принципы подачи учебного материала:
1. Положительный эмоциональный фон занятия.
2. Опора на эмоции и чувства обучающихся.
3. Связь обучения с жизнью и практикой.
4. Наглядность.
5. Научность, доступность, посильная трудность.
6. Групповой характер обучения с учетом индивидуальных особенностей детей.
Методы обучения (на основе дидактических задач):
Частично-поисковый метод
Метод развития познавательного интереса
Беседа, выполнение практической работы
Предполагаемый результат учебного занятия:
1. Появление у детей интереса к занятиям биологией, к исследованию, эмоционально-положительный настрой,
2. Сформированность у детей первоначального представления о наследственности и молекуле ДНК
Этапы учебного занятия. Тезисный план учебного занятия.
Вводный этап.
Знакомство с детьми и их увлечениями;
представление педагога;
сообщение цели учебного занятия: знакомство с некоторыми приемами исследовательской и проектной деятельности.
Актуализация знаний.
Приходилось ли вам слышать, что ребенка называют исследователем? Как вы думаете, может ли кто-нибудь из нас провести исследование, создать проект? Чем отличается проект от исследования?
Выслушивается мнение детей, педагог подводит итог.
Исследование - это поиск истины, познание неизвестного, поиск неизвестного, один из видов познавательной деятельности человека.
Давайте обсудим, как и где человек может проводить исследования. Что такое научное исследование? (Научные исследования - это такие, которые проводят ученые.)
Где и как используют люди результаты научных исследований?
Чем отличается проект от исследования? (это планирование деятельности ученого и предполагаемого результата)
Давайте перечислим те качества, которые просто необходимы для того, чтобы стать хорошим исследователем? (Уметь наблюдать, высказывать свою точку зрения и доказывать ее, анализировать.)
Как вы понимаете, что значит наблюдать?
Вывод. Наблюдение - это самый популярный и доступный метод исследования, применяемый в большинстве наук. Постоянно используется наблюдение обычным человеком в повседневной жизни. Оно служит ценнейшим и совершенно неоценимым источником получения разнообразных сведений о мире. Ученые для наблюдения могут использовать различные приборы и приспособления - телескопы, микроскопы, измерительные приборы.
Сегодня я предлагаю Вам побывать в роли ученых, исследователей.
Актуализация знаний о клетке.
Слайд с клеткой.
Что это за объект исследования в живой природе?
Попробуйте определить принадлежность к типу организма.
Скажите, какие части клетки вам знакомы.
Сейчас мы посмотрим анимацию «Жизнь клетки», попробуйте узнать в ходе просмотра эти части.
Что напоминает жизнь клетки? (город, завод)
Знакомство с ДНК.
Что управляет жизнью клетки? (ядро, хромосомы, гены, ДНК)
Молекула ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - это одна из основных молекул жизни, которая полностью управляет клеткой. Представьте, что клетка – это завод с программным управлением, а ДНК – его программа. В каждой клетке есть специальные системы, которые считываю заложенную в ДНК «программу» и на её основе создают новые белки (выполняют в клетке огромное количество функций – от строительства до регуляции заложенных в ДНК инструкций). Эта информация закодирована особым образом, называется код ДНК или генетический код. Молекула ДНК имеет вид двойной спирали и хранит всю наследственную информацию об организме.
Практическая работа «Выделение ДНК».
Я предлагаю вам тему для исследования - «Выделение ДНК».
У нас сегодня работают 2 группы ученых, каждая из которых выделяет ДНК из разных объектов. Выберите руководителя группы, лаборантов. (жребий по выбору объекта)
Инструктаж по ТБ.
Оформление отчета о выполненной работе. В средних классах удобно фиксировать результаты работ в виде таблицы с тремя столбцами: 1 – что делали, 2 – что наблюдали, 3 – выводы. Сделать в тетради рисунок с соответствующими подписями.
У каждой группы свое оборудование, объект, инструкция. Давайте продумаем этапы работы. Как нам проникнуть внутрь клетки и ядра? (измельчение ткани, разрушение стенки клетки с помощью моющего средства). Соль- отделить белки от нитей ДНК. ДНК не растворяется в спирту и образует видимый осадок.
Обсуждение итогов работы.
Отчет группы. Посмотрите на чашку у другой группы. Сравните внешний вид осадка. Есть ли явные отличия в ДНК у этих объектов? О чем это Вам говорит? (универсальность молекулы). Как Вы думаете, почему мы выделяли молекулы не у человека, а у растений? (кол-во материала, температура тела).
Для чего ученые применяют выделение ДНК ( изучение, ДНК дактилоскопирование, определение родства детей и родителей и т.д.)
Заключительный этап. Закрепление полученных знаний.
Сбой программы – брак – изменение наследственности - мутации. Мутации носят различный характер. Мы для себя их оцениваем с точки зрения пользы и вреда. (слайды с примерами мутаций).
7. Подведение итогов занятия и рефлексия
Педагог подводит итоги занятия появление и поддержание мотивации к углубленному изучению биологии.
У каждого живого организма есть свой дом. Т.е. среда жизни. Среда жизни -это его стихия. Организму там уютно, комфортно. Всем известно, что человек имеет свою стихию (на слайде представлены 4 стихии). Каждый поставит свой знак, который он выбрал на соответствующую секцию.
Воздух ( фигурка птицы) – мне на занятии было легко. Я повысил свои знания и доволен своей работой на уроке.
Огонь ( фигурка дракона)– заинтересовался материалом. «загорелся» узнать побольше нового.
Вода ( фигурка рыбы)– «Утонул» в теме урока. Ничего не понял.
Земля ( фигурка лошади)– твердо знаю материал.
Уходя с урока, какую вы бы для себя выбрали стихию?
infourok.ru
Качановский е.А., Ушаков в.Л.
12
Московский ордена Трудового Красного Знамени инженерно-физический институт (государственный университет) Министерства высшего и профессионального образования РФ.
Методические рекомендации к выполнению работ по курсу “Биофизический практикум”
Москва – 2002 г.
Учебное пособие “Методы исследования биологических объектов”
Содержание.
I) Выделение молекул ДНК из клетки, определение степени ее очистки, конформации и концентрации в растворе.
II) Дополнение к лабораторной работе № 9 “Реакция Белоусова - Жаботинского”. Качественные периодические реакции.
III) Оптическая активность биологических молекул.
IV) Количественное определение белка в растворе.
Л А Б О Р А Т О Р Н А Я Р А Б О Т А №1
Выделение днк.
Цель работы: познакомиться с основными принципами и практическими приемами выделения и очистки ДНК из тканей животного и растительного происхождения.
В в е д е н и е
Теоретическая часть работы взята из УСПЕХИ СОВРЕМЕННОМ БИОЛОГИИ ТОМ 91, (1981), ВЫП. 1, с.49 – 59/ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ВЫСШИХ РАСТЕНИИ Мирошниченко Г. П., Дьяченко Л. Ф.
К настоящему времени мы располагаем довольно большим набором методов экстракции и очистки растительных ДНК, причем эти методы продолжают совершенствоваться и модифицироваться применительно к новым объектам исследования. Использование того или иного метода выделения ДНК диктуется, во-первых, спецификой изучаемого материала, а во-вторых, тем, какая преследуется цель: получение суммарной, ядерной, хлоропластной ДНК или других ее препаратов. Ядерная ДНК, как правило, представляет наибольший интерес, поскольку служит матрицей для транскрипции генов. В приложении 5 приведена схема регуляции транскрипции генов.
Метод выделения ДНК должен быть относительно простым, хорошо воспроизводимым и давать возможность быстрого получения достаточных количеств удовлетворительно очищенных препаратов ДНК. В связи с разнообразием живых объектов универсальных методов выделения ДНК (а тем более из высших растений) не существует. При выделении ДНК из растений приходится сталкиваться с целым рядом методических сложностей, связанных с низким содержанием ДНК в растительном материале, трудностью разрушения клеток, а также с большим количеством примесей (полисахаридов, пигментов, дубильных веществ), затрудняющих очистку ДНК. При этом надо учитывать структурные особенности и регуляцию функционирования внутриклеточных ферментативных систем. Например, внутри лизосом, где происходит расщепление протеинов и липидов, для работы протеаз создается за счет работы протонных насосов кислый pH=4, в то время, как внутрицитоплазменный порядка 7,2. Роль основных внутриклеточных посредников и их вид приведены в приложении 7. В приложении 8 указаны примеры рецепторов-протеинкиназ, механизм действия которых основан на регуляции активности белков за счет их фосфорилирования.
Выход ДНК зависит от природы исходного материала и обусловлен содержанием ДНК в данной ткани, а также наличием и характером примесей, препятствующих очистке ДНК. Для растительных объектов выход ДНК обычно ниже, чем для тканей животных (например, при выделении ДНК из свежих листьев ценой больших усилий удается получить до 0,1 мг/г листьев). Качество получаемого препарата ДНК определяется задачами дальнейшей работы. В любом случае ДНК должна содержать минимальное количество примесей полисахаридов и белков (не более 2—3%),что отражается на такназываемых спектральных характеристиках препаратов ( А260/А230 ≥ 2,0; А260/А280 ≥ 1,8—1,9). Содержание РНК в чистых препаратах ДНК также недолжно превышать 2—3%. Любой полученный препарат ДНК должен соответствовать определенным критериям чистоты, нативности и полимерности.
Получение ДНК из митохондрий и пластид растительной клетки достаточно специфично. В данной работе приведено рассмотрение методов, используемых для выделения и очистки препаратов суммарной ДНК, а также ядерных ДНК из тканей высших растений.
Удобнее всего выделять ДНК из молодых тканей и органов высших растений (например, из проростков или луковиц). В ряде случаев наиболее доступным в больших количествах растительным материалом служат листья. Однако уже перечисленные трудности получения высокоочищенных препаратов ДНК из растений встречаются прежде всего при работе именно с листьями. При выделении препаратов суммарной ДНК из листьев необходимо учитывать, что при этом часть ДНК будет представлена хлоропластной ДНК (см. приложение 1). Как показали авторы, крупные листья содержат вдвое большее количество хлоропластной ДНК по сравнению с ядерной. Для средних листьев количество хлоропластной ДНК примерно одинаково с ядерной ДНК, для малых листьев треть всей ДНК листа находится в хлоропластах.
Предпочтительно выделять ДНК из свежего растительного материала, который сразу замораживают жидким азотом, что способствует ингибированию ДНКаз. Замороженные жидким азотом ткани и органы растений иногда хранят до выделения ДНК при -20°С. Замороженный материал можно также размельчить до порошкообразного состояния, лиофилизировать и хранить при комнатной температуре без доступа влаги. Разработан даже способ выделения ДНК из растительных объектов, фиксированных спиртом.
Начальный этап процесса выделения ДНК - разрушение клеточных оболочек. Существующие способы разрушения тканей можно разделить на три группы: 1) механическое растирание, размалывание, гомогенизация; 2) применение ферментов, специфически расщепляющих компоненты клеточных стенок; 3) сочетание механического разрушения с ферментной деградацией. Для гомогенизации тканей используют специальные измельчители с ножами, вращающимися при высоких скоростях: 10-40 тыс. об/мин. Этот способ предпочтительно применять для молодых, легко разрушающихся растительных тканей. Фиксированный материал гомогенизируют в присутствии этанола.
Удовлетворительного механического разрушения тканей удается достичь при растирании их в охлажденной ступке с отмытым соляной кислотой кварцевым песком, порошкообразной окисью алюминия, измельченным стеклом. Метод широко применяется для разрушения различных тканей, в частности вегетативных и генеративных органов гороха, мышиного горошка, табака, яблони, ландыша, меристематических тканей лука, проростков салата. Его используют также и для разрушения лиофилизированного материала. Меньшее распространение получил способ разрушения клеток различными прессами.
В последнее годы начали интенсивно развиваться ферментативные методы разрушения клеточных оболочек, приводящие к получению протопластов. Несомненное их преимущество - отсутствие нежелательных жестких механических воздействий, приводящих к деградации высокополимерных молекул ДНК. Это весьма существенно, если для дальнейшей работы требуется высокополимерная ДНК, например для изучения репликации ее в клетке. Кроме того, при использовании протопластов увеличивается выход ДНК за счет снижения потерь на различных этапах очистки от полисахаридов, что дает возможность уменьшить количество исходного материала до нескольких граммом. Однако при всех своих достоинствах этот метод выделения ДНК из протопластов сопряжен с трудностью получения самих протопластов.
Учитывая химический состав клеточных стенок, для их лизиса используют различные пекто- и целлюлолитические ферменты. Сначала ткань мацерируют, используя пектиназы. Самая активная среди известных пектиназ - мацерозим, выделенный из гриба Rhyzopus, несколько менее активен препарат пектинол R-10. Разрушение клеточных стенок проводят в среде, содержащей 0,4-0,7М маннит или сорбит, с помощью так называемых целлюлазных комплексов - сложных систем ферментов, в состав которых входят С1-фермент и Сх-фермент, а также целлобиаза, гидролизующие различные типы связей в молекулах полисахаридов. Эффективность действия целлюлазного комплекса зависит от наличия в нем всех трех, а возможно, и большего количества отдельных компонентов. Целлюлазные комплексы, выделенные из различных источников, известны обычно под своими фирменными названиями. Широко используются, например, препараты «Оnozuka R-10» (Япония) и «Сеllulysin» (США), полученные из Trichoderma viride, «Сеllulase» (США) - из Aspergillus niger; отечественная промышленность производит ферментные препараты целлокандин, целловиридин, целлолигнорин, а также ксиланигрин и ксиланазу, выделяемые из различных микроорганизмов. Эти препараты также могут быть использованы для получения протопластов из высших растений.
Как правило, для успешного лизиса клеточных стенок экспериментально для каждой ткани подбирают состав и концентрацию растворов, рН, состав и концентрации ферментов, время и температуру инкубации. Для целого ряда тканей уже разработаны оптимальные условия получения протопластов.
По данным литературы, выход протопластов составляет более 95%. Протопласты легко разрушаются осмотическим шоком или детергентами. При этом в гомогенат переходят интактные ядра и различные клеточные органеллы. Лизис протопластов можно также проводить в присутствии детергентов, например, тритона Х-100, нонидета Р-40.
Получение растительных протопластов используется как промежуточный этап препаративного выделения хлоропластной и ядерной ДНК. При этом лизат протопластов центрифугируют в градиенте плотности сахарозы для разделения субклеточных органелл и получения из них чистых препаратов ДНК. Следует отметить, что требования к протопластам, предназначенным для выделения из них ДНК, отличаются от требований, предъявляемых при необходимости их дальнейшего культивирования, когда на первый план выступает проблема сохранения жизнеспособности протопластов.
Суммируя сказанное выше, можно заключить, что выбор метода разрушения растительной ткани определяется конечной задачей работы, спецификой ткани и другими причинами. Для разрушения нежных эмбриональных тканей удобно использовать гомогенизацию, растирание в ступке. Фиксированный материал или ткани с прочными клеточными оболочками следует измельчать в ступках или мельницах при замораживании жидким азотом. Для выделения отдельных типов ДНК (ядерной, хлоропластных) наиболее целесообразны ферментативные методы разрушения клеточных оболочек.
Для получения высокополимерного препарата ДНК необходимо ингибировать освобождающиеся при разрушении клеток нуклеазы. Примерный состав клеток приведен в приложении 2. Для снижения активности нуклеаз процесс выделения проводят на холоду (от 0° до +2°С), в неоптимальной для их действия щелочной среде. При гомогенизации тканей в среду вводят ингибиторы: ЭДТА, цитрат натрия и другие соединения, связывающие ионы Мg2+, необходимые для действия ДНКаз. В разной степени ДНКазы подавляют ион арсената, фторид и хлорид натрия в высокой концентрации, фенол, парааминосалициловая кислота (4-амино-2-гидроксибензойная кислота), детергенты, бентонит. Активным ингибитором ДНКаз служит ауринтрикарбоновая кислота в концентрациях 10-50 мМ. Кроме того, вследствие термолабильности ДНКазы частично денатурируют в результате прогревания лизатов тканей при 55-60°С.
Для получения препарата суммарной ДНК после разрушения ткани проводят лизис клеточных и ядерных мембран. В качестве лизирующего агента чаще всего применяют додецилсульфат натрия (SDS) (н-С12Н25SО4Nа) в концентрациях 1-5%. SDS способствует лизису мембран и ядер, увеличивает выход и улучшает депротеинизацию ДНК. Депротеинизирующий эффект SDS заключается в том, что при связывании его с белком образуются растворимые комплексы. SDS интенсивно разрушает водородные и гидрофобные связи в молекулах белков, растворяет многие ранее не растворимые белки. Комплексы белка с SDS приобретают значительный отрицательный заряд из-за сульфогрупп иона додецилсульфата.
Мембрана
Гидрофильный участок белка
Рис. 1. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.
Солюбилизированный белок
Кроме SDS, для лизиса тканей применяют и другие детергенты: 1%-ный триизопропилнафталинсульфонат (изо-С3Н7)3С10Н4SО3Nа, 1%-ный цетилтриметиламмоний бромид (С16Н24(СН3)3N+Br-) (цетавлон), 4%-ный додецилсаркозинат натрия (С11Н21СОN(СН3)СН2СООNа) (саркозил). Каждый из них обладает своими достоинствами и недостатками. SDS выпадает в осадок на холоду и в присутствии калия. Саркозил растворим на холоду, но образует нерастворимые соли с Мg2+и Мn2+. Триизопропилнафталинсульфонат активно ингибирует нуклеазы, но также образует нерастворимые соли с магнием и марганцем. Кроме того, последние два детергента интенсивно поглощают свет при 260 нм. Додецилсаркозинат натрия применяют в том случае, когда планируется дальнейшая очистка ДНК в хлориде цезия, так как в отличие от SDS он растворим в этой соли.
Помимо детергентов, в лизирующие смеси иногда вводят протеолитические ферменты бактериального происхождения, не теряющие активности при повышенной температуре (до 60°С). Особенно эффективна протеиназа К («Sigma», США), которая обладает очень широкой субстратной специфичностью. Активация этого фермента более чем в 7 раз в присутствии мочевины и SDS обусловлена главным образом денатурацией белков-субстратов в этих условиях.
В литературе описаны некоторые приемы, используемые в ряде случаев при лизисе и обеспечивающие на последующих этапах выделения ДНК из растений ее очистку от окрашенных примесей. Характерная особенность высших растений - наличие в их тканях большого количества полифенольных соединений, к которым относятся водорастворимые пигменты и дубильные вещества. Лизис клеток сопровождается окислением полифенолов за счет активации клеточных полифенолоксидаз. В результате возникают окрашенные продукты, которые наряду с имеющимися в клетках водорастворимыми растительными пигментами способны необратимо связываться с ДНК, препятствуя ее дальнейшей очистке. Окрашенные примеси в препаратах ДНК могут влиять на результаты количественного определения ДНК в препарате химическими методами, на определение РНК в ДНК орциновым методом и белка по Лоури, а также на величину отношения А260/А280, т. е. характеристики окрашенных препаратов ДНК не будут отражать их истинных свойств. Универсальных методов очистки растительных ДНК от окрашенных примесей, к сожалению, не существует. Имеются указания на эффективность обработки размельченных растительных тканей диметилсульфоксидом ((СН3)2SО2) при - 40°С для удаления пигментов и нуклеаз перед экстракцией ДНК. На последних этапах выделения очищенную от полисахаридов и белков окрашенную ДНК можно пропустить через сефадекс G-50. При этом пигменты выходят из колонки после ДНК. Желтую и коричневую окраску препаратов ДНК иногда удается устранить обработкой 2-метоксиэтанолом на последних этапах очистки. Одновременно удаляются некоторые полисахариды и белки. Однако при использовании 2-метоксиэтанола наблюдаются значительные потери ДНК. Более эффективная очистка от окрашенных примесей достигается, если для предотвращения окисления полифенольных соединений в лизирующую смесь добавляют антиокислители (например, аскорбиновую кислоту в восстановленной форме, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол или 8-оксихинолин). С этой же целью при лизисе используют диэтилдитиокарбамат ((С2Н5)2NCSSNa), ингибирующий полифенолоксидазы. Иногда его применяют в сочетании с поливинилпирролидоном, который связывает полифенольные соединения. Таким способом можно получать чистые препараты ДНК из растений, отличающихся высоким содержанием дубильных веществ (например, из хвощей и папоротников). Иногда помимо добавления в лизирующую смесь поливинилпирролидона и диэтилдитиокарбамата требуется дальнейшая очистка ДНК от пигментов, например методом гель-фильтрации. Однако следует отметить, что без использования вышеупомянутых соединений на начальных этапах выделения все попытки очистить ДНК от пигментов на последующих стадиях могут оказаться безрезультатными.
После лизиса обычно проводят многократную депротеинизацию полученного лизата. При этом происходит разрушение химических связей, поддерживающих третьичную и четвертичную структуру белка (виды и энергия связей в биологических молекулах приведены в приложении 3). Для этого к нему добавляют различные соединения, обеспечивающие диссоциацию нуклеопротеидных комплексов (NаС1, NаС1О4, мочевину), а затем агенты, денатурирующие белки. Выбор депротеинизирующих агентов определяется конкретными условиями и задачами дальнейшей работы с выделяемыми препаратами ДНК.
Несмотря на широкое распространение, методы депротеинизации ДНК фенолом и хлороформом обладают рядом серьезных недостатков. Один из них состоит в разрушении высокополимерных молекул ДНК на фрагменты при механическом встряхивании с этими депротеинизирующими агентами. Кроме того, имеются сведения, что фенол избирательно экстрагирует сателлитную ДНК АТ-типа, вызывает увеличение потерь ДНК при выделении. Обработка фенолом на 10% снижает вязкость ДНК, понижает температуру плавления, приводит к изменениям богатых ГЦ-парами участков. При использовании хлороформа могут происходить потери связанной с мембранами или гетерохроматиновой ДНК. При количественном определении потерь нуклеиновых кислот за счет двукратной обработки фенолом и хлороформом оказалось, что теряется примерно четвертая часть ДНК. При двукратной обработке хлороформом потери ДНК составляют 16%. Хлороформ избирательно экстрагирует однонитчатую ДНК: ~54% при трех обработках.
Потерь ДНК, вызываемых обработкой фенолом или хлороформом, удается избежать при использовании препаративных градиентов СsСl. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности дает возможность получать высокоочищенные препараты ДНК. Наличие СsСl в высокой концентрации (2-4 М) вместе с 5 М мочевиной иногда приводит к полной диссоциации нуклеопротеидных комплексом. Принцип метода очистки состоит в том, что ДНК и примеси (РНК, белки, полисахариды) различаются по плавучей плотности. Плотность СsСl и условия центрифугирования подбирают так, чтобы РНК осаждалась на дно, белок всплывал на поверхность, а ДНК располагалась близко к центру пробирки.
Этот метод не является простым или экономичным в смысле времени и оборудования, однако ценность его заключается в том, что он очень эффективен при наличии малых количеств исходного материала. После очистки равновесным центрифугированием в СsСl препараты ДНК содержат <1% РНК, <1% белка, характеризуются высоким гиперхромизмом, гомогенностью по молекулярному весу. Кроме того, очистка в градиенте СsСl позволяет избавиться от некоторых примесей, влияющих на скорость реассоциации ДНК.
Эффективная очистка препаративных количеств ДНК растений может быть проведена в градиенте плотности смеси СsСl и бромистого этидия. Бромистый этидий делает полосу ДНК видимой и позволяет ингибировать гидролиз ДНК.
В отличие от методов выделения ДНК с использованием центрифугирования в градиенте СsСl методы с применением депротеинизации хлороформом и фенолом требуют дополнительной очистки препарата от примесей РНК. Традиционный способ очистки ДНК от РНК - ферментативная деградация последней в присутствии панкреатической РНКазы А; в ряде случаев дополнительно используют РНКазу Т1. Одновременно с РНКазой иногда рекомендуется применять α-амилазу для удаления оставшихся в препарате полисахаридов. Внесенные в раствор ДНК ферменты удаляют депротеинизацией фенолом или хлороформом, а ДНК осаждают изопропанолом.
При использовании методов выделения растительных ДНК, в основу которых положена методика Мармура, удается получать удовлетворительно очищенные препараты ДНК, однако выход ДНК относительно невысок (10—20 мг/кг свежих листьев).
studfiles.net
Способы получения ДНК
Методы выделения ДНК
ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе.
Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения, т.е. при 280 и 260 нм, соответственно. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей, полученных при 260/280 нм, должно быть больше 1,8.
Молекула ДНК одной хромосомы среднего размера содержит 150х106 пар нуклеоти-дов и имеет длину около 4 см. Молекулы такого размера чувствительны к механическим воздействиям, возникающим в растворе в процессе выделения, и часто фрагментируются. В ходе выделения получают молекулы ДНК значительно меньше исходных, но всё равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать.
Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.
Препараты ДНК, получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь — от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.
При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз. После удаления основной массы белков препараты дополнительно депротеинизируют хлороформом с октанолом или фенолом. Нередко их обрабатывают также рибонуклеазами и протеолитическими ферментами, обычно проназой.
Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы 0,15 М Nad, содержащим 0,015 М цитрат натрия, лизисе клеток при 60° и рН 8,0 в 0,15 М NaCI, содержащем ЭДТА и 2% додецилсульфат натрия, депротепнизации их хлороформом, содержащим изоамиловый спирт, переосаждении спиртом, повторной многократной депротеинизации, обработке рибонуклеазой и осаждении изопропиловым спиртом. Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.
Прибор для работы с ДНК-материалом. Фото: Burt Lum
Практические последствия возможности работы с ДНК
В настоящее время стало очевидным, что достижения в области молекулярной биологии способны сильно изменить практическую медицину. Они не только углубили наши знания об экспрессии генов и причинах многих болезней, но способствовали разработке новых подходов к их диагностике и лечению.
Было установлено, что полиморфизм генов широко распространён в популяции людей, показана взаимосвязь между изменениями в структуре ДНК и многими болезнями. Идентификация генов, нарушение работы которых приводит к развитию наследственных заболеваний, создала предпосылки для подробного анализа генетических и биохимических основ патогенеза этих заболеваний и разработки наиболее эффективных методов лечения.
Методами молекулярной медицины были созданы вакцины для предотвращения гепатитов, инсулин человека - для лечения сахарного диабета, фактор VIII - для восстановления нормального свёртывания крови и лечения гемофилии и многие другие препараты.
С помощью генной терапии оказалось возможным вводить в организм больного полноценно работающие гены и таким образом восстанавливать метаболические нарушения, вызванные мутантными генами. Таким путём осуществляется лечение детей с иммунодефицитом, вызванным дефектом аденозиндезаминазы, в стадии клинических испытаний находятся методы гено-коррекции таких наследственных болезней, как семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В, муковисцидоз и некоторые другие.
Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из соответствующего источника (биологической жидкости, биоптата, культуры клеток и т.д.) и "наработана" в количествах, достаточных для исследования. Для генно-терапевтических работ необходимы выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки таким образом, чтобы они экспрессировались, позволяя восстановить здоровье пациента.
В настоящем разделе будут даны основные представления о методах, используемых в решении проблем ДНК-диагностики наследственных болезней и генной терапии.
Видео: Выделение ДНК из лука biofile.ru
Выделение ДНК из растений при помощи протеиназы К — Zbio
Материал из Zbio
;
- гомогенизировать проросток массой 100mg в эппендорфе 1.5ml в присутствии 500µl лизирующего буфера при помощи специального пестика
- инкубировать 1 час при 55°C[1]
- внести равный объём смеси хлороформ:изоамиловый спирт 24:1
- вортексировать до образования белой эмульсии
- центрифугировать 4 мин., 14krpm
- верхнюю водную фазу перенести в другой эппендорф
- внести равный объём изопропанола (~600µl) или 2 объёма этанола
- аккуатно перемешать
- ДНК осадить при помощи центрифугирования 4 мин., 14krpm
- слить супернатант
- внести 1ml 70% этанола
- центрифугировать 2 мин., 14krpm
- слить супернатант, просушить осадок ДНК
- растворить ДНК в 500µl ТЕ-буфера с 1µg/ml РНКазы А и инкубировать 30 мин. при 37°C[2]
Лизирующий буфер:NaCl 100 mM, EDTA 100 mM, TrisHCl 100 mM, SDS 1%, Triton X-100 0,1%, Протеиназа К 100 мкг/мл (добавлять непосредственно перед выделением)
- Данная методика позволяет выделить тотальную ДНК из этиолированных проростков достаточной для ПЦР степени очистки, также может применяться для выделения ДНК из листьев, побегов и др. органов растения, но присутствие хлорофилла может помешать, поэтому для выделения из фотосинтезирующих тканей лучше применять модификацию данного метода с использованием активированного угля. Выход ДНК из 100mg растительного материала составляет ~40µg[3]
- протокол использовался в ??? лаборатории в течении ???
- типичные результаты:
[править] сноски
- ↑ На этой стадии можно внести РНКазу А до 1µg/ml и инкубировать 30 мин. при 37°C
- ↑ Если РНКазная обработка была произведена до стадии депротеинизации, растворить осадок в ТЕ без РНКазы А
- ↑ Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях/Под. ред. Ю. М. Сиволапа. — Киев: Аграрна наука. — 1998. —С. 36
molbiol.ru
Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот
Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) из образцов тканей растений, а также продуктов переработки растительного и животного происхождения. Возможно использование изобретения в медицине, биотехнологии, осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля. Способ выделения и очистки ДНК основан на том, что образец подвергают лизису в буфере на основе анионного детергента (SDS), лизат подвергают очистке и дезоксирибонуклеиновую осаждают этанолом или изопропанолом. Очистку лизата проводят суспензией детонационного наноалмаза, избирательно сорбирующим примеси ненуклеиновой природы. Детонационный наноалмаз предварительно отжигают в температурном интервале 400-700°С в вакууме 10-2-10-3 Торр. Полученный раствор ДНК содержит как короткие, так и длинные фрагменты. Предлагаемый способ выделения и очистки ДНК позволяет избежать использования таких высокотоксичных соединений, как фенол и хлороформ. Предотвращается загрязнение полученной ДНК химически активными веществами. При случайном попадании детонационного наноалмаза в конечный раствор полимеразная цепная реакция не блокируется, при этом имеется возможность отделить нерастворимый осадок детонационного наноалмаза от раствора ДНК. 3 ил, 1 табл.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот из образцов тканей растений, а также продуктов переработки растительного и животного происхождения. Возможно использование изобретения в медицине, биотехнологии, при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.
Выделение и очистка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из фрагментов органов растений и продуктов переработки сырья растительного и животного происхождения с целью проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одной из основных задач молекулярной биологии. В настоящее время используются следующие способы выделения ДНК.
Известен способ выделения ДНК из растительных тканей с использованием лизирующего буфера, последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта и осаждением изопропанолом [1]. Способ заключается в том, что 100 мг фрагмента растения лизируют в 400 мкл буферного раствора (2% СТАВ, 1.4М NaCI, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCI), после добавления 10 мкл РНКазы инкубируют при 65°C в течение 60 мин. После этого проводят двукратную промывку лизата 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (92:8) с промежуточным центрифугированием и переносом супернатанта в чистую пробирку. Далее проводят осаждение ДНК в присутствии 350 мкл изопропанола, центрифугирование и удаление супернатанта. Осадок ДНК промывают 400 мкл 70% этанола, сушат в течение 60 мин при комнатной температуре.
Недостатком данного способа является продолжительность выделения ДНК (более 2 часов), необходимость использования высокотоксичных летучих веществ (хлороформа и изоамилового спирта), низкое качество ДНК при высоком содержании блокирующих ПЦР веществ (хлорофилла, танинов), многостадийность способа.
Известен способ выделения и очистки ДНК, основанный на адсорбции нуклеиновых кислот на твердом сорбенте [2]. Образец смешивают с буферным раствором на основе хоатропного агента. Нуклеиновую кислоту сорбируют на стекловолокнистом сорбенте, предварительно обработанном 0,1-7% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 часов. В дальнейшем проводят отмывку сорбента от полимерных составляющих ненуклеиновой природы. Элюцию ДНК проводят буферным раствором или дистиллированной водой.
Недостатком данного способа является зависимость количества выделенной ДНК от объема сорбента (2,3 мкг ДНК на 1 мг сорбента), снижение выхода ДНК в результате необратимой адсорбции и потерей в результате отмывки сорбента.
Известен способ выделения и очистки ДНК, основанный на адсорбции нуклеиновых кислот на твердом сорбенте [3]. Нуклеиновую кислоту сорбируют на аэросиле (А-300) при нужной концентрации хаотропного агента путем добавления к пробе аэросила до конечной концентрации от 0,3 до 0,6%, смесь инкубируют 1-2 мин, аэросил с сорбированной НК осаждают центрифугированием, промывают 80%-ным изопропанолом. ДНК элюируют водой или буфером с низким содержанием солей.
Недостатком данного метода является трудоемкость, повреждение ДНК при большой концентрации, связанное с необходимостью проведения механического ресуспендирования сорбента во время отмывки ДНК, снижение выхода ДНК в результате необратимой адсорбции.
Из известных технических решений наиболее близким (прототипом) по назначению и технической сущности к заявляемому объекту является SDS-метод выделения ДНК [4] с использованием лизирующего буфера на основе додецилсульфата натрия (SDS). Примерно 2 см2 листьев растений положили в 1,5 мл пробирку, добавляли 400 мкл экстрактионного буфера ((200 мМ Tris-НС1, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, рН 7,5) 10 мкл РНКазы и инкубировали 15 мин при температуре 65°C. Далее добавляли 200 мкл 5М ацетата калия, перемешивали и на 10 мин ставили в ледяную воду. После 15 мин центрифугирования при максимальном ускорении 500 мкл верхней фазы переносили в новую пробирку. Добавляли 400 мкл очистительного раствора (92% хлороформа и 8% изоамилового спирта), 1 мин центрифугировали при 12000 g. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку и повторяли промывку раствором на основе хлороформа и изоамилового спирта. ДНК осаждали 500 мкл изопропанола, 10 мин центрифугировали при 12000 g. Надосадочную жидкость удаляли, осадок промывали в 70% этаноле. Этанол удаляют; осадок ДНК просушивают в течение 1 часа при комнатной температуре и растворяют в 100 мкл дистиллированной воды или ТЕ-буфера.
Прототип имеет следующие недостатки, устраняемые заявляемым изобретением.
Многостадийность метода, необходимость задействования 4-х пробирок в каждом выделении и, соответственно, 3-кратного переноса раствора ДНК, в результате чего происходит механическое повреждение молекул при прохождении через наконечник пипетки.
Необходимость работы с токсичными веществами - хлороформом и изоамиловым спиртом - наносит вред здоровью исследователя и налагает ограничение на широкое использование метода.
Часто невозможно полностью очистить ДНК от хлорофилла и других пигментов, в результате чего происходит ингибирование ПЦР, сокращается срок хранения выделенной ДНК.
Сущность способа выделения и очистки ДНК заключается в том, что, в отличие от прототипа, очистку биологического раствора после лизиса образца в буфере на основе анионного детергента (например, додецил сульфата натрия - SDS) проводят суспензией предварительно отожженного в вакууме детонационного наноалмаза, являющегося гидрофильным сорбентом со слабым положительным зарядом и сильно развитой удельной поверхностью. В результате из раствора удаляются примеси, ингибирующие полимеразную цепную реакцию - пептиды, пигменты, танины, липиды. Последующее центрифугирование раствора позволяет разделить детонационный наноалмаз с адсорбированными примесями и супернатант, содержащий ДНК. Далее ДНК осаждают спиртом (изопропанолом или этанолом) и растворяют в дистиллированной воде.
Осуществление способа выделения и очистки ДНК достигается следующим образом.
Предварительно проводят подготовку суспензии 30 мг отожженного в течение 1-2 часа в вакууме (10-2 - 10-3 Торр) при температуре 300-700°C детонационного наноалмаза в 100 мкл буферного раствора (200 мМ Tris-HCl, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5).
Лизис 50 мг образца тканей растений или продукта на основе сырья растительного или животного происхождения проводят в 400-500 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл рибонуклеазы в течение 15-20 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирке. Полученный лизат центрифугируют при ускорении 12000 g в течение 2 мин. Надосадочную жидкость в объеме 300-400 мкл (в зависимости от влажности образца тканей) переносят в чистую 1,5 мл пробирку.
Очистку 300-400 мкл полученного биологического раствора проводят добавляя суспензию до конечной концентрации детонационного наноалмаза 5-10% и перемешивают в течение 1 мин. После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата калия или натрия, перемешивают 1 мин и охлаждают до температуры 0°C в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 5-10 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. В результате из раствора удаляются примеси ингибирующие полимеразную цепную реакцию - пептиды, пигменты, танины, низкомолекулярные соединения.
Из подготовленного раствора ДНК осаждают 1 мл 96% этанола или 400 мкл изопропанола, центрифугируют 2-3 мин при ускорении 12000 g, надосадочную жидкость удаляют.
Осадок промывают в 70% этаноле, сушат в открытой пробирке 2 мин при температуре 65°C и растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
Пример 1
Для выявления оптимальных условий предварительной подготовки сорбента проводят прокаливание 6 образцов детонационного наноалмаза (ТУ 84-112-87, производство ФНПЦ «Алтай») в вакууме (10-2 Toрр) при температуре от 300°C до 700°C в течение 1 часа.
Выделение ДНК производят из 6-и проб 50 мг живых тканей листа Allium sativum L. Предварительно проводят подготовку суспензии на каждую пробу 30 мг детонационного наноалмаза в 100 мкл буферного раствора (200 мМ Tris-HCl, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5).
Лизис 6 одинаковых образцов тканей растений проводят в 400 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл РНКазы в течение 15 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирках. Полученный лизат центрифугируют 2 мин при 12000 g. Надосадочную жидкость переносят в чистые 1,5 мл пробирки.
Очистку полученного биологического раствора проводят введением суспензии детонационного наноалмаза и затем перемешивают в течение 1 мин переворачиванием пробирок. Очистку проб проводят различно подготовленными детонационными наноалмазами в следующей комбинации:
проба №1 - предварительный отжиг наноалмазов при 300°C;
проба №2 - предварительный отжиг наноалмазов при 400°C;
проба №3 - предварительный отжиг наноалмазов при 500°C;
проба №4 - предварительный отжиг наноалмазов при 600°C;
проба №5 - предварительный отжиг наноалмазов при 700°C.
После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата натрия и охлаждают до температуры 0°C в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. Из раствора ДНК осаждают 400 мкл изопропанола.
Осадок промывают в 70% этаноле и растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
В итоге было получено 6 образцов раствора ДНК, качество которых проверяют спектрофотометрически, результаты измерений представлены в таблице 1.
Соотношение угасания на длинах волн ДНК и белка (OD260/OD280) для очень чистой ДНК имеет диапазон от 1,7-1,8 и выше. Таким образом, максимальное выделение ДНК (OD260/OD280=2,1) получают при прокаливании детонационного наноалмаза при 500°C в течение 1 часа, наилучшее качество - при прокаливании детонационного наноалмаза в температурном интервале от 400 до 700°C в течение 1 часа.
Пример 2
Для оценки качества ДНК проводят выделение из засушенных и хранившихся в течение 5 лет листьев Hedysarum neglectum Ledeb. с подготовкой 6 образцов детонационного наноалмаза аналогично примеру 1, за исключением того, что лизис проводят в течение 40 мин. В результате получают 6 образцов ДНК в зависимости от температуры подготовки детонационного алмаза. Длину полученных фрагментов ДНК оценивают постановкой электрофореза в 1% агарозном геле в течение 3 ч при напряжении 2,5 В/см, используя для оценки длины эталона 100 bp (базовых пар нуклеотидов) маркер молекулярного веса. После окрашивания геля раствором бромида этидия ДНК фотографируют в УФ-излучении 312 нм (Фиг.1). Выявляют стабильность длины фрагментов выделенной ДНК вне зависимости от условий подготовки детонационного наноалмаза. Наибольшее содержание ДНК выявляют по свечению для образца №3, что соответствует температуре подготовки детонационного наноалмаза 500°C.
Пример 3
Для подбора RAPD-праймеров и выявления видоспецифичных маркеров проводят выделение ДНК из 30 мг листьев Papaver somniferum L. и Papaver orientale Bieb.
Лизис двух образцов тканей разных видов растений проводят в 500 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл РНКазы в течение 30 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирках. Полученный лизат центрифугируют 2 мин при 12000 g. Надосадочную жидкость переносят в чистые 1,5 мл пробирки.
Очистку полученного биологического раствора, проводят введением в каждую пробу суспензии 100 мкл буфера и 30 мг детонационного наноалмаза предварительно отожженного при 450°C в течение 2 часов в вакууме (10-3 Toрр). После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата натрия и охлаждают в морозильной камере в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 5 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. Из раствора ДНК осаждают 800 мкл 96% этанола. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, и после сушки осадок ДНК растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
Амплификацию проводили с коммерческими RAPD-праймеами. Амплифицированную ДНК разгоняют на агарозном 1,5% геле при 5 В/см в течение 2,5 часов параллельно с маркером молекулярного веса. Гель окрашивают раствором бромида этидия и визуализируют в УФ-излучении (Фиг.2). По фотографии геля выявляют различия в паттернах образцов S и O, что соответствует различию геномов двух видов.
Данный пример подтверждает возможность использования выделенной с помощью разработанного метода ДНК для решения задач типификации и молекулярной систематики растений с помощью RAPD-метода.
Пример 4
Выделение ДНК производят из свежевысушенных листьев Hedysamm theinum Krasnob, аналогично примеру 3, полученную ДНК используют для амплификации ITS 1-фрагмента в термальном цикл ере BioRad с помощью ПЦР-набора «Медиген». Использовали праймеры:
ITS-1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'),
ITS-2 (5'-GCTGCGTTCTTCАТСGATGC-3').
Амплифицированную ДНК разгоняют на агарозном 1,5% геле при 5 В/см в течение 2,5 часов параллельно с маркером молекулярного веса и контрольной пробой. Гель окрашивают раствором бромида этидия и визуализируют в УФ-излучении (Фиг.3). Выявляют амплифицированный участок ДНК (паттерны №1 и №3) длиной около 700 bp. Впоследствии амплифицированный участок очищают из геля с использованием набора NucleoSpin и секвенируют. Расшифрованная последовательность амплифицированного участка сравнивают с сиквенсом ITS 1-фрагментом других видов рода Hedysarum, взятых из свободно доступных Интернет-баз данных. Таким образом, нуклеотидная последовательность ДНК, в случае выделения указанным способом, не нарушается и молекула ДНК не модифицируется. Данный пример подтверждает возможность использования полученной с помощью разработанного метода ДНК для расшифровки ее последовательности методом секвенирования.
Предлагаемый способ выделения и очистки ДНК позволяет избежать использования таких высокотоксичных соединений как фенол и хлороформ. Полученный таким способом раствор ДНК содержит как короткие, так и длинные фрагменты. Предотвращается загрязнение полученной ДНК химически активными веществами. Благодаря характерной черной окраске детонационного наноалмаза облегчается процесс разделения фракций - после центрифугирования отчетливо видна граница разделения фаз. При случайном попадании детонационного наноалмаза в конечный раствор полимеразная цепная реакция не блокируется, при этом имеется возможность отделить нерастворимый осадок детонационного наноалмаза от раствора ДНК. Ввиду постоянства размеров наночастиц детонационного наноалмаза, вне зависимости от условий синтеза сохраняется стабильность величины адсорбционной емкости очистительной суспензии.
Литература
1. Doyle J.J. and J.L.Doyle. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. // Phytochemical Bulletin, 1987. - T.19. - P.11-15.
2. Патент РФ №2272072, кл. C12N 15/10, опубл. 20.03.2006.
3. Патент РФ №2119954, кл. C12N 15/10, С07Н 21/00, С07Н 21/02, С07Н 21/04, опубл. 10.10.1998.
4. Фризен Н. Молекулярные методы, используемые в систематике растений. - Барнаул: Азбука, 2007. - 64 с.
Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот, заключающийся в том, что после лизиса образца в буфере на основе анионного детергента проводят очистку раствора и ДНК осаждают спиртом, отличающийся тем, что для очистки раствора используют суспензию детонационного наноалмаза до конечной концентрации от 5 до 10% при рН 7,5, предварительно отожженного при температуре от +400° до +700°С в вакууме от 10-2 до 10-3 Торр, затем добавляют ацетат калия или натрия, перемешивают, охлаждают смесь при 0°С, центрифугируют и разделяют детонационный наноалмаз, сорбирующий вещества ненуклеиновой природы, и супернатант, содержащий ДНК.
www.findpatent.ru
