5.Этапы микроклонального размножения растений in vitro. In vitro микроклональное размножение растений
5.Этапы микроклонального размножения растений in vitro.
1)выбор раст-й донора, взятие экспланта (часть органа / ткани раст-й, выращ-й на пит среде / использ-ся для получ калуса) и изолирование экспланта, его стерилизация и введение в культуру in vitro.
2)МКР in vitro через калус бок. побегами, эмбриойдами.
3)Укоренение побегов подращ-я и накопление растений (хранение t 2-10°).
4)Пеесадка раст-й в субстрат / почву, адаптация к внешним условиям (in vivo - внутри клети??). Высадка в теплицу, реализация.
6.Экспланты
Экспланты- часть органа или такни, для культивирования in vitro или получения каллуса.
Выбор экспланта зависит от: вида раст-я, времени года, фазы развития растений и развития органов из к-х взят эксплант
Эксплантами могут быть: меристемы, часть листа, цветоложе, тычинки, лепестки, часть стебля.
Корни сложно стерилизовать из-за наличия микоризы. А видоизмененные побеги можно брать.
Получение эксплантов:
Хорошо перевод-ся в культуру in vitro 2400 видов культивир в фазу актив-го роста. Но лилии Весной/осенью, летом плохо. Тюльпаны в период покоя (как листья засохнут их выкапывают).
Для грубых Э стерилизац р-ром сулимы (выдержка 5-10 мин), для нежных гипохлорит натрия NaCIO и Гипохлорит кальция ca(clo)2конц 5-9 % 5-15 мин. Для уничтож эпифитной микрофлоры.
Самое вложное при введение культуры в ин витро - стерильность. Можно стерил антибиотиками.
Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм. В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений.
Культивирование растений из апикальных меристем позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур.
Получение микрочеренков
Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов.
7) Методы стерилизации эксплантов.
В период акт роста утром берут Э с раст-й (верхушки побегов) -> лаб -> укорач-т, облам-т листья -> склад в марлевый мешочек -> этикетка -> промывка в мешочке 2 часа -> 20 мин в тёпл воде + перемешивание с добавл-м ПАВ
Экспланты подвергают стерилизации. Берут мешочек, на нем этикетка. Сначала промывают водой 2 часа, встряхивают 20 минут, затем растворяют ядовитые вещества р-р сулимы HgCl2 – 0,1 % 5-7 мин, NaClO и Ca(Cl0)2 – 5-7% 10-15 минут, промывают водой стерильной 3-5 раз, затем вычлиняют меристемы, если оздорав от вируса, то 0,1-0,3 мм, если просто размнож-е 1-2 мм. -> помещают в пробирку со средой Мурасига-Скуга. В ламинарном боксе высушивают на питательную среду, применяют антибиотики.
8) Питательные среды и условия выращивания растений in vitro.
Питательная среда Мурасига-Скуга вводят макро – микроэлементы, витамины В1 В6 С РР, тиамин, пиридоксин, фолиевая кислота, хлористый кальций, хелат железа, глицин, 6-БАП, глюкоза, также вносят агар для застывания среды.
Огласно модели М-С:
1)высокие дозы АУК в среде вызыв образ-е калуса
2)при соотноше УИК к кинетину 1:1-10 из калуса образ-ся стебли
3)при УИК к кинетину 1:100, 1:10 образ-ся КС
Все работы по микроклональному размножению проводят асептически в ламинарном боксе, в котором дует ветер 0,4 м/с. Включают продувку за 30 минут. Рядом на столе готовят стерильную чашку Петри, 2 салфетки, пит среду, бумажные колпачки, поддоны, штативы. Вымыть руки спиртом, сесть в бокс и принять салфетки, протереть салфеткой стол, чашку Петри, инструменты (пинцет и ножик), питательную среду.
Большинство растений выращ при t 20-25°, для троп 30, лук / нарциссы / тюльпаны 18.
studfiles.net
Микроклональное размножение. Оптимизация условий микроклонального размножения.
Введение
Методы культуры клеток и тканей широко используется для размножения декоративных растений в развитых странах. В настоящее время более одного миллиарда продаваемых декоративных растений производится посредством культуры тканей. Из них значительная часть представлена цветами на срез и горшечными растениями. На долю декоративных многолетников и садовых растений приходится лишь 2% от общего числа растений, полученных методом in vitro. В соответствие с этим варьирует и объем торговли. Так, согласно оценкам экспертов, декоративные многолетники ежегодно продают на сумму 8 млрд. долларов США, тогда как емкость рынка цветов на срез и горшечных растений превышает в десятки раз и составляет 90 и 60 млрд. долларов США, соответственно. Как видно, существует большая потребность и резервный потенциал для применения методов культуры тканей в размножении декоративных многолетников и садовых растений [1].
Одним из ценных декоративных многолетников является культура клематиса. Род Clematis L. относится к семейству лютиковых Ranunculaceae Juss. и насчитывает около 300 видов, которые встречаются в 28 флористических областях Земли Большинство сортов клематисов по жизненной форме являются лианами [2].
Клематис обладает рядом важных свойств, которые определяют его коммерческую ценность для декоративного озеленения в Казахстане. Прежде всего, это высокая декоративность и разнообразная цветовая гамма этой культуры. Клематисы восхищают белыми, розовыми, красными, лиловыми, фиолетовыми цветками. Гармоничное сочетание колеров позволяет создавать уникальные декоративные композиции для ландшафтного озеленения.
Традиционно клематисы размножают семенами и вегетативно. Семенное воспроизводство используется в основном в селекционной работе для получения новых сортов. С точки зрения получения стандартного посадочного материала существенным недостатком размножения семенами является расщепление основных признаков исходного сорта. Отмечается высокая степень гетерогенности полученных сеянцев по окраске и форме цветков, по высоте и срокам цветения растений. Поэтому для сохранения исходных признаков все сорта размножают только вегетативно: черенками, отводками, прививкой [3]. Однако, вегетативное размножение достаточно медленное, трудоемкое, зависит от природных условий, недостаточно эффективно и способствует накоплению инфекции в растительном материале [4]. Необходимы альтернативные способы для ускорения клонального размножения клематиса и получения массового посадочного материала. Целью данного исследования является оптимизация питательной среды для ускоренного и массового размножения клематиса Clematis alpina сорта «Ruby».
Материалы и методы
Объектом исследований являлся высокодекоративный сорт клематиса Clematis alpina сорта «Ruby» из коллекции АО «Лесной питомник». Эксплантами для введении в культуру in vitro служили различные органы растений: листовые сегменты, узловые сегменты с пазушными почками и сегменты междоузлий, взятые с растений, активно вегетирующих в условиях фитотрона.
Эффективность режима стерилизации оценивали по степени освобождения от инфекции, по токсичности и максимальному выходу жизнеспособных эксплантов. Предварительно исходный материал тщательно промывали в проточной водопроводной воде 1-1,5 часа, после чего ополаскивали дистиллированной водой. Дальнейшая обработка проводилась в ламинарном боксе. В качестве стерилизующего агента использовали сулему, соединение, которое обладает сильным дезинфицирующим действием и часто применяется для дезинфекции растительного материала [5].
Для поиска оптимального режима стерилизации были применены различные варианты стерилизации, различающиеся по времени обработки стерилизующими агентами: 70% этиловым спиртом и 0,1% раствором сулемы.
Для культивирования эксплантов в качестве основной среды использовали среду Мурасиге и Скуга (МС). С целью оптимизации гормонального состава было изучено 7 вариантов сред с разными комбинациями и концентрациями фитогормонов: бензиламинопурина (БАП), индолилмасляной кислоты (ИМК), индолилуксусной кислоты (ИУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), гибберелловой кислоты (ГК). В качестве антиоксиданта в питательную среду вносили аскорбиновую кислоту (АК). Гормональный состав сред представлен в таблице 1.
Таблица 1 – Гормональный состав питательной среды МС
Наблюдения за ростом и развитием пробирочной культуры проводили каждую неделю и фиксировали результаты. Повторность опыта трехкратная.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных нами экспериментов было установлено, что последовательная обработка 70% раствором этилового спирта в течение 30 сек и обработка 0,1% раствором сулемы в течение 8 мин дает положительные результаты. При использовании такого способа дезинфекции выход жизнеспособных эксплантов был максимальным и составлял 90,9%.
Результаты экспериментов по влиянию режима стерилизации на выход жизнеспособных эксплантов приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Влияние режима стерилизации на жизнеспособность эксплантов Clematis alpina сорт Ruby в условиях in vitro
Как видно из данных, представленных в таблице 2, наибольшее число инфицированных эксплантов отмечалось в варианте опыта, где дезинфекция эксплантов осуществлялась только 0,1% сулемой. Предварительная обработка 70% спиртом значительно понижала инфицированность и увеличивала выход жизнеспособных эксплантов до 90,9%. Следовательно, кратковременное выдерживание в этаноле – обязательный этап для эффективной стерилизации растительного материала. Обработка этиловым спиртом необходима для удаления с поверхности эксплантов воскового налета и для усиления действия стерилизующих веществ. В результате первого режима стерилизации 0,1% сулемой в течение 5 минут количество зараженных эксплантов составило 5 шт, что свидетельствует о недостаточной экспозиции для удаления спорофитной микрофлоры.
Выбор экспланта для последующей индукции процессов роста и развития в условиях in vitro играет очень важную роль. По литературным данным для микроклонального размножения клематисов часто используют конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями, латеральные почки вегетирующих побегов и узловые сегменты [6-8].
В наших экспериментах были использованы различные экспланты, изолированные в феврале-марте с маточных растений, начинающие вегетацию в условиях фитотрона.
Установлено, что сегменты листьев обладали высокой способностью к каллусогенезу, почти 100%. На всех испытанных вариантах среды появление плотного зеленого каллуса отмечалось на месте среза и первые видимые признаки каллусогенеза отмечались на двадцатый день культивирования (рисунок 1, А).
Рисунок 1 – А - образование каллуса на листовых сегментах на среде МС с 1 мг/л БАП и 0,3 мг/л НУК; Б - образование каллуса на сегментах междоузлий на среде МС с 2 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л АК
Сегменты междоузлий также обладали способностью к каллусогенезу, но не столь высокой. Данные экспланты продуцировали белый рыхлый каллус на поверхности срезов. Каллусогенез проходил на тех же двух вариантах среды с внесением фитогормонов 2,4-Д и БАП (Рисунок 1, Б). Индуцированные каллусы сильно отличались по структуре и окраске. Если каллус, полученный из листьев, имел плотную консистенцию и ярко- зеленую окраску, то каллус, образовавшийся из черенков, был белым и сильно обводненным. Для индукции органогенеза плотный каллус далее пассировали на среду для регенерации с внесением 4 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИМК и 10 мг/л АК. Однако культивирование каллуса в течение месяца не дало положительных результатов, каллус разрастался без видимых признаков дифференцировки.
Более успешным для индукции морфогенеза in vitro было использование узловых сегментов побега с пазушными почками. У этих эксплантов отмечалось отрастание побегов и закладка дополнительных почек через 3 недели культивирования на индуцирующей среде с 1 мг/л БАП и 10 мг/л АК.
Выявлено, что на эффективность регенерации пазушных почек существенное влияние оказывал размер экспланта. Экспланты с почками от пяти мм длиной и более формировали жизнеспособные побеги, тогда как у почек меньшего размера формирования побегов не происходило (Рисунок 2 А, Б).
Рисунок 2 – Экспланты клематиса с недоразвитыми почки (А) и прорастание пазушных почек и формирование побегов на среде МС с 1 мг/л БАП и 10 мг/л АК (Б)
Следовательно, для размножения клематисов in vitro рекомендуется использовать экспланты с почками размером более 5 мм, которые хорошо выживают в культуре, обладают высокой скоростью роста и формируют побеги.
Выявлено, что на регенерационную способность эксплантов микрочеренков существенно влияет гормональный состав питательной среды (таблица 3).
Таблица 3 – Влияние гормонального состава среды МС на прорастание пазушных почек Clematis alpina сорт Ruby
Из данных, представленных в таблице 3 видно, что процент прорастания почек варьировал от 66 до 100% в зави
articlekz.com
Особенности микроклонального размножения косточковых культур в условиях in vitro
Published on05-Apr-2017
View230
Download0
Transcript
Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 291 В. В. Роговая, М. А. Гвоздев ОСОБЕННОСТИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ IN VITRO В работе представлен обзор, в котором рассматриваются особенности методов микроклонального размножения косточковых плодовых культур в системе in vitro. Особое внимание уделено методу размножения пазушными почками и методу регенерации адвентивных побегов из листовых эксплантов вишни, черешни, персика и абрикоса. Рассмотрены вопросы оздоровления рас- тений от различных патогенов и тестирования растительного материала косточковых культур на наличие вирусных инфекций. Впервые микроклональное размножение провел французский ученый Жорж Морель на орхидеях в 50-х годах ХХ века. В своих работах он использо- вал технику культивирования апикальной меристемы растений. Растения, полу- ченные таким образом, были свободны от вирусной инфекции. В нашей стране исследования по оздоровлению растений методом мери- стем и по клональному микроразмножению начались в 60-х годах в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР [1]. Микроклональное размножение — получение in vitro растений, генетиче- ски идентичных исходному экспланту (метод вегетативного размножения рас- тений в культуре in vitro). В основе микроразмножения лежит уникальное свой- ство соматической растительной клетки — тотипотентность — способность клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма [2]. В настоящее время все большую актуальность приобретают различные методы микроклонального размножения сельскохозяйственных культур (прежде всего вегетативно размножаемых) в системе in vitro: размножение пазушными и адвентивными почками, непрямой морфогенез, соматический эмбриогенез. Использование этих методов дает возможность: – ускорять селекционный процесс, в результате этого сроки получения товарной продукции сокращаются до 2–3 лет вместо 10–12; – получать за короткий срок большое количество оздоровленного, безви- русного материала, генетически идентичного материнскому растению; – работать в лабораторных условиях и поддерживать активно растущие растения круглый год; – размножать растения практически без контакта с внешней средой, что исключает воздействие неблагоприятных абиотических и биотических факторов; – получать максимальное число растений с единицы площади; – в короткий срок получать большое число растений трудноразмножае- мых или вегетативно неразмножаемых; – при выращивании растений с длительной ювенильной фазой можно ус- корять переход от ювенильной к репродуктивной фазе развития; – длительно (в течение 1–3 лет) сохранять растительный материал в ус- ловиях in vitro (без пассирования на свежую среду) [3, 4], ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 292 – создавать банки длительного хранения ценных форм растений и от- дельных их органов; – разрабатывать методы криосохранения оздоровленного in vitro мате- риала [5, 6]. Этапы микроклонального размножения косточковых плодовых культур и тестирование на наличие вирусных инфекций Процесс микроклонального размножения включает несколько этапов. Ос- новными из них являются [7–10]: 1-й этап — введение экспланта в культуру in vitro; 2-й этап — микроразмножение; 3-й этап — процесс укоренения микропобегов; 4-й этап — осуществление выхода укорененных растений из стерильных условий в нестерильные. Важным этапом в методике микроразмножения растений in vitro является выращивание безвирусных маточных форм растений в вегетационных домиках или изолированных боксах в зимних теплицах, в условиях, недоступных для переносчиков вирусов. Растения-доноры эксплантов для последующего введе- ния в культуру in vitro должны быть протестированы на наличие вирусных, ми- коплазменных и бактериальных инфекций с помощью методов ПЦР- диагностики либо молекулярной гибридизации, либо иммуноферментного ана- лиза (ИФА) [10, 11]. Метод ИФА позволяет в сжатые сроки выявлять подавляющее большин- ство вирусов, заражающих косточковые культуры: вирусы карликовости сливы, некротической кольцевой пятнистости косточковых, потивирус шарки слив, не- повирусы скручивания листьев черешни. Клоны, оказавшиеся свободными от контактных вирусов по результатам проверки методом ИФА, подвергают затем основному тестированию, включающему серологические тесты в сочетании с тестом на растениях-индикаторах. Растениям, оказавшимся по результатам тес- тирования свободными от вирусов и других регламентируемых патогенов, при- сваивается категория «безвирусных» базисных клонов. В случае выявления ин- фекции исходные растения могут подвергнуть оздоровлению. Для оздоровле- ния растений косточковых культур от вирусов наиболее целесообразно сочетать методы суховоздушной термотерапии и культуры in vitro. Если с помощью культуры изолированных апикальных меристем не удается освободиться от тестируемых вирусов, используют методы хемотерапии, основанные на введе- нии в питательные среды химических веществ, ингибирующих развитие вирус- ной инфекции в растениях in vitro [11]. Иногда для активного выявления бактериальной микрофлоры среды обо- гащают различными органическими добавками, например гидролизатом казеи- на, который провоцирует развитие сапрофитных микроорганизмов [7, 12–14]. Оценку зараженности проводят визуально через 7-10 дней. «Чистые» экспланты помещают на питательные среды для дальнейшего культивирования. Практи- куют на этой ступени и применение сред, лишенных ростовых веществ [7, 15]. Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 293 Введение в культуру in vitro и микроразмножение плодовых косточковых культур При клональном микроразмножении плодовых косточковых культур в ка- честве источника эксплантов обычно используют верхушечные и боковые поч- ки, а также меристематические верхушки. Вычленение верхушечной меристемы проводят по общепринятым методикам после ступенчатой стерилизации расти- тельного материала [13, 16]. Для микроклонального размножения косточковых культур используют различные среды: для микроразмножения вишни — среды Пиерика, Готре, Уай- та, Хеллера [12, 17], для вишни и сливы — среду Розенберга, модифицирован- ную для плодовых культур [18] и для сливы — среду Лепуавра и В5 [12, 19]. Но наиболее подходящей для микроклонального размножения вишни, черешни и сливы является питательная среда Мурасиге—Скуга (МС) [12, 16, 17, 19–27]. В зависимости от этапа микроклонального размножения плодовых кос- точковых культур к питательным средам добавляют 6-бензиламинопурин (6- БАП) в концентрациях 0,2–2 мг/л [5, 8, 13, 17, 20, 28]. На этапе введения в куль- туру in vitro используют более низкую концентрацию цитокинина — 0,2 мг/л БАП [8, 20, 27]. Для индукции пролиферации пазушных почек с целью получе- ния максимального числа побегов микрорастения вишни культивируют с до- бавлением БАП, в концентрациях 0,5–2 мг/л [5, 8, 12, 13, 17, 20, 22, 28–30], микрорастения сливы 0,5 — 1 мг/л БАП [16, 19, 20, 27]. Процесс укоренения микропобегов Особого внимания требует этап укоренения. Процесс укоренения in vitro побегов плодовых косточковых культур зависит от сортовых особенностей [5, 27], от числа проведенных пассажей, от концентрации и типа ауксина, от спо- соба его применения [21]. Для получения полностью сформированных микро- растений плодовых косточковых культур из среды исключается 6-БАП, препят- ствующий процессам ризогенеза, и в среды вводятся ауксины, в основном — β-индолил-3-масляная кислота (ИМК) [5, 8, 10, 13, 16, 18, 22, 26, 27]. Установ- лено, что оптимум концентраций ИМК в составе питательной среды находится в пределах 0,5–1 мг/л [8, 17, 18, 20, 21, 27, 31–33]. Присутствие в среде ИМК в концентрации 2 мг/л вызывает образование гипертрофированных корней [17, 27]. Совместное введение в среду для укоренения препарата рибав (1 мл/л) и традиционных фитогормонов ауксинов [ИМК и β-индолилуксусной кислоты (ИУК) по 0,5 мг/л каждого] повышает процент укоренения побегов ряда сортов косточковых культур [12]. При сравнительном изучении индукторов корнеобразования: ИМК, ИУК и α-нафтилуксусной кислоты (НУК), была выявлена высокая эффективность ИУК в концентрации 6,0 мг/л [27]. Наибольшее число укоренившихся микроче- ренков вишни было получено на среде, содержащей НУК [8, 17]. Однако при этом на базальном участке побегов происходило интенсивное разрастание кал- луса, что затрудняло перенос пробирочных растений с корнями в нестерильные условия. ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 294 Для эффективного укоренения пробирочных растений косточковых куль- тур большое значение имеет не только тип стимулятора, но и способ его аппли- кации. Помимо введения ауксинов в питательную среду, для индукции ризоге- неза используют предварительное замачивание побегов в стерильном водном растворе ИМК (25–30) мг/л при экспозиции 12–24 часа [8, 12, 13, 17, 20]. Про- веденные эксперименты показали, что обработка микрочеренков водным рас- твором ИМК более эффективна, чем введение этого регулятора в культураль- ную среду. Массовое появление первых придаточных корней при применении предварительной обработки индуктором ризогенеза отмечалось на 20–25 день [8, 17]. Еще одним способом индукции ризогенеза является обработка побегов плодовых косточковых культур тальковой ауксинсодержащей пудрой ИМК с концентрацией 0,125%, 0,25% [12, 20, 27] и ИУК с концентрацией 0,25%, 0,5% [27]. При использовании гормональной пудры отмечалась высокая эффектив- ность и технологичность применения индукторов ризогенеза [20]. Но использо- вание тальковой пудры ИМК с разными концентрациями ауксина выявило сор- товую специфику при укоренении микрочеренков сливы [27]. Процесс ризогенеза наиболее интенсивно протекает на модифицирован- ных средах МС и Уайта [17]. По другим данным [16, 26] лучшей средой для корнеобразования являются среды с макроэлементами по Хеллеру с добавлени- ем витаминов и разбавленная вдвое среда МС с пониженным содержанием са- харозы 15 мг/л и с исключением мезоинозита, способствующего образованию каллусной ткани. Однако в большинстве работ для укоренения микропобегов косточковых культур используется среда Мурасиге и Скуга [16, 17, 19–23, 26, 27]. Методы микроклонального размножения Существует несколько способов микроклонального размножения расте- ний in vitro: • методы размножения пазушными почками; • методы размножения адвентивными почками; • непрямой морфогенез; • соматический эмбриогенез. Для любого типа регенерации in vitro можно выделить четыре группы факторов, определяющих ее успех: генотип и состояние исходного родитель- ского растения; условия и методы культивирования; состав питательных сред; особенности введения экспланта в стерильную культуру [1]. Влияние генотипа на эффективность микроразмножения Наиболее существенное влияние на эффективность микроразмножения оказывает генотип. Реакция растений на условия асептического культивиро- вания зависит от сортовых особенностей и объясняется разной регенераци- онной способностью сортов плодовых и ягодных культур [25]. Например, при использовании метода клонального микроразмножения для ускоренного размножения новых сортов вишни сортовые особенности оказались домини- рующими факторами в способности растений к микроразмножению [34]. Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 295 Сортовые различия проявлялись как на стадии пролиферации, так и на ста- дии корнеобразования [5]. Среди эксплантов разных сортов одного и того же вида плодовых расте- ний нередко наблюдается разная степень проявления реакции на включаемые в среду регуляторы роста, что, видимо, отражает, в какой-то мере эндогенное со- держание ростовых веществ, которое является генетически обусловленным признаком вида или сорта [35]. В то же время реализация морфогенетического потенциала в культуре зародышей in vitro, у гибридов между видами Cerasus vulgaris, C. maackii, C. fruticosa, Padus racemosa в основном определялась гено- типом и в меньшей степени зависела от состава питательной среды [34]. Условия культивирования Еще одним фактором, определяющим успех микроразмножения растений, являются условия их культивирования. Оптимальными условиями культивиро- вания косточковых плодовых культур являются: температура 22–26 °С для виш- ни, черешни [8, 17, 24, 26] и 26–28 °С — для сливы [20, 27], освещенность 2000–5000 лк — для вишни, черешни [8, 10, 17, 25, 26] и 3500 лк для сливы [19, 20, 27] при 16-часовом фотопериоде. Микрорастения должны выращиваться в климатических камерах или в комнатах с регулируемым режимом. Необходимо отметить, что у сортов вишни на этапе пролиферации увели- чение коэффициента размножения и повышение доли побегов, пригодных к укоренению, может обеспечить прием чередования минеральных составов пи- тательных сред и использование ламп синего света (ЛП 1) [12]. Большое коли- чество побегов косточковых культур — до 30 — может образовываться при го- ризонтальной ориентации регенерантов [22]. Для увеличения коэффициента размножения в первых пассажах конгломераты почек и побегов косточковых культур можно не разделять на отдельные единицы, а переносить на свежую питательную среду целиком. При использовании этого приема величина коэф- фициента размножения резко возрастает и может достигать 40–70 за пассаж в зависимости от сорта [13]. Метод размножения пазушными почками непрямой морфогенез Самым надежным методом микроклонального размножения является ме- тод регенерации растений через развитие пазушных почек [9]. Преимущество этого метода состоит в сравнительно быстром размножении исходного геноти- па, при этом обеспечивается наиболее высокая фенотипическая и генотипиче- ская стабильность. Потенциальные возможности такого способа микроразмно- жения in vitro реализуются при добавлении в питательные среды цитокининов, которые подавляют развитие верхушечной почки стебля и стимулируют обра- зование пазушных почек [36]. В основе процесса микроклонального размножения вишни методом куль- туры изолированных верхушечных меристем лежит явление снятия апикально- го доминирования, что способствует последующему развитию уже существую- щих меристем и обеспечивает генетическую однородность посадочного мате- ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 296 риала. Снятие апикального доминирования достигается путем добавления ци- токининов. Для многих сортов вишни характерна высокая митотическая актив- ность апекса, что способствует формированию разветвленного конгломерата почек и боковых микропобегов [8]. Генетическая стабильность получаемого in vitro материала зависит от мо- дели размножения. Процесс размножения плодовых косточковых растений свя- зан с пролиферацией пазушных меристем. Генетическая стабильность — неотъ- емлемое свойство меристемы, которое может быть сохранено in vitro, если по- следняя культивируется в условиях, ингибирующих формирование каллуса. Ес- ли используются среды, стимулирующие образование каллуса, то может воз- никнуть генетическая вариабельность [37]. Для получения более высоких коэффициентов размножения питательные среды часто обогащают кроме препаратов цитокининовой природы веществами из группы ауксинов, стимулирующими развитие каллусной ткани. Комбинации этих двух препаратов применяют для индукции органогенеза в каллусных тка- нях. В системе каллус—побег организованная структура побега может воздей- ствовать на процессы органогенеза, стимулируя меристематизацию каллусных клеток, которые могут давать начало органам с измененными свойствами. Про- стое варьирование содержания регуляторов роста, добавляемых к питательной среде для достижения максимальной пролиферации клеток, может оказывать влияние на генетическую стабильность получаемого материала [37]. Метод размножения адвентивными почками и непрямой морфогенез Адвентивными почками называются почки, возникшие непосредственно из тканей и клеток эксплантов растений, обычно их не образующих [2]. Адвен- тивные (или придаточные) почки образуются из меристемных зон, чаще всего сформированных вторично из тканей каллуса. Адвентивные почки могут воз- никнуть из меристемы и немеристемных тканей (листьев, стеблей). Образова- ние адвентивных почек у многих видов растений индуцировано высоким отно- шением цитокининов к ауксинам в питательной среде. Регенерация побегов, корней или эмбриоидов из соматических раститель- ных клеток экспланта может происходить через непрямую регенерацию — об- разование каллуса и формирование побегов, или через «прямую» регенерацию, когда клетки экспланта становятся способными к регенерации без формирова- ния каллусных тканей [38]. Адвентивные побеги могут образовываться на эксплантах листьев, череш- ков, корней и других органов растений различных видов косточковых и плодо- вых культур [39–45]. Получение побегов непосредственно из эксплантов в ряде случаев используют для клонирования растений, но при этом могут появляться генетически нестабильные растения [21]. Поэтому указанный метод регенера- ции растений можно применять для индукции генетически разнообразных рас- тений. Побеги-регенеранты могут быть индуцированы из различных частей лис- товой пластинки, но наибольшей способностью к регенерации обладают ткани Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 297 основания листа, поскольку в этой зоне листовой пластинки расположены наи- более активные меристематические клетки. Необходимо также учитывать, что морфогенетический потенциал листьев увеличивается по мере их расположения к верхушке стебля. Придаточные побеги лучше регенерируют из молодой меристематической ткани развивающихся листьев. Однако при использова- нии более старых листьев значительно чаще возникают генетически изме- ненные побеги [21]. Для регенерации побегов плодовых косточковых культур, таких как вишня, черешня, персик, абрикос, из исходных эксплантов (целых листьев и их сегментов) используются различные среды: Мурасиге––Скуга (МS), Ллойда и Мак Коуна (WPM), Драйвера и Куниюки (DKW), Курена и Лепуав- ра (QL) [39–45]. Для экспериментов по адвентивной регенерации вишни и черешни чаще всего используется среда Ллойда и Мак Коуна для древесных растений — Woody Plant Medium (WPM), дополненная различными стимуляторами роста [39, 40, 42]. Из цитокининов в основном используют 6-БАП, тидиазурон (TDZ), из ауксинов — НУК [40, 45], ИМК [39, 44], 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) [42]. Важно отметить, что среди зарубежных исследователей [39, 40] нет еди- ного мнения об эффективности применения в регенерации побегов TDZ по сравнению с БАП, о типе экспланта (целые листья, с нанесенными на них попе- речными разрезами или сегментированные) и о способе культивирования экс- плантов (абаксиальной или адаксиальной поверхностью вверх). Высокий процент регенерации наблюдался у целых листовых эксплантов черешни (с нанесенными на них поперечными разрезами вдоль центральной жилки листа), которые помещали абаксиальной (нижней) поверхностью вверх на среду WPM, дополненную 2,27 или 4,54 µМ TDZ + 0,27 µМ НУК [40]. С другой стороны, в работе [39] показано, что БАП более эффективен, чем TDZ, в регенерации растений из листьев вишни и черешни а также то, что БАП и НУК в концентрации 2 мг/л и 1мг/л являются оптимальной комбинацией ре- гуляторов роста растений вишни и черешни. Наибольшая частота регенерации была получена на среде WPM, хотя она стимулировала каллусогенез больше, чем среды MS, QL, DKW. Выявлена зависимость эффективности каллусообра- зования от типа листовых сегментов. Так, наиболее высокие показатели каллу- сообразования отмечены на средних листовых сегментах; наиболее низкие — на верхушечных сегментах и прямая регенерация (без образования каллуса) от- мечена на базовых сегментах. Адвентивная регенерация вишни черной (Prunus serotina Ehrh.) происхо- дила чаще при культивировании эксплантов листьев на среде WPM, дополнен- ной TDZ по сравнению с модифицированной средой DKW [44]. На эффективность адвентивной регенерации дикой вишни (Prunus avium L.) существенное влияние оказывал размер экспланта. Результаты показали, что размер листового экспланта имеет критическое значение для образования ад- вентивных побегов, листья длиной 3-5 мм формировали наибольшее число ад- вентивных побегов. Для адвентивной регенерации дикой вишни использовалась среда WPM, дополненная 0,54 mМ НУК и 4,4 mМ TDZ [45]. ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 298 Специальная предварительная обработка до культивирования (замачива- ние с добавлением 5 мг/л 2,4-Д в течение одного дня) оказалась эффективной для индукции адвентивных побегов из листовых эксплантов черешни [42]. По- следующее культивирование эксплантов листьев на регенерационной агаризо- ванной среде WP, дополненной 5 мг/л TDZ, повышало эффективность адвен- тивной регенерации черешни. Молодые листовые экспланты черешни показали более высокую способность к регенерации, чем старые. Необходимо отметить существенное влияние этиленовых ингибиторов на адвентивную регенерацию листьев различных сортов абрикоса. Например, в работе [43] было показано, что применение этиленовых ингибиторов (тиосуль- фата серебра или аминоэтоксивинилглицина) совместно с низким содержанием канамицина увеличивает адвентивную регенерацию более чем на 200%. Ис- пользование чистого агара также улучшало регенерацию из листьев абрикоса по сравнению с использованием агар-геля или агарозы. В данной работе иссле- дования проводились на средах LQ, DKW, дополненные TDZ и НУК. Способ культивирования листьев — адаксиальной поверхностью к среде. Итальянскими исследователями [41] был разработан метод адвентивной регенерации из целых листьев персика, которые инкубировались в темноте на средах, дополненных 6-БАП и НУК. В исследованиях использовались комбина- ции макросолей и микросолей различных сред по MS, Quoirin, Rugini и Muganu, оба цитокинина — 6-БАП и TDZ, а также способ культивирования листьев — адаксиальной поверхностью в контакте с регенерационной средой. В основании черешков листьев развивался каллус. Адвентивные побеги появлялись на этом каллусе после переноса на среду, не содержащую ауксин, и культивирования на свету. Морфогенетическая способность каллуса сохранялась в течение несколь- ких месяцев. В данных исследованиях адвентивные побеги персика появлялись путем непрямого морфогенеза. Непрямой морфогенез включает вторичную дифференциацию почек из каллусных тканей. Для образования каллуса, из которого затем формируются побеги, используют разнообразные экспланты. Для получения морфогенного каллуса у многолетних растений следует брать верхушки побегов или выделен- ные из них участки меристематических тканей. Такая система не рекомендуется для микроклонального размножения растений in vitro из-за генетической неста- бильности. Непрямой морфогенез имеет значение для изучения сомаклональ- ной изменчивости и получения сомаклональных вариантов [9, 36]. В Великобритании, в отделе физиологии экспериментальной станции Мейдстон, изучалась регенерация растений из стеблевого и листового каллу- са у подвоя черешни Кольт. Инициацию каллуса осуществляли на среде Му- расиге—Скуга, содержащей 2,0–10,0 мг/л НУК. Образовавшийся каллус пе- реносили на среду для регенерации, которая содержала БАП в концентрации 0,5 мг/л. Удалось осуществить регенерацию побегов из каллусов у данного подвоя черешни [46]. В Центральной генетической лаборатории имени И. В. Мичурина в куль- туре пассированных каллусных тканей, полученных из однолетних побегов вишни, отмечалось корнеобразование. При пересеве на среду с регуляторами роста наблюдалось появление меристематических образований [47]. Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 299 Соматический эмбриогенез Еще одним методом микроклонального размножения растений in vitro яв- ляется соматический эмбриогенез — процесс формирования зародышеподоб- ных структур из соматических (неполовых) клеток. Соматический зародыш — независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой образуется структура, в которой одновременно развиваются апексы стебля и корня. Образование соматических зародышей в культуре клеток, тканей и орга- нов может происходить прямым или непрямым путем. Прямой соматический эмбриогенез — формирование вегетативного зародыша из одной или несколь- ких клеток ткани экспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких этапов: помещение экспланта в культуру, последующая стимуляция роста каллуса и формирование из каллус- ных клеток предзародышей, перенос каллуса на питательную среду без факто- ров роста для формирования биполярных зародышей из предзародышей [9]. В работе [48] исследовалась возможность регенерации растений из каллу- сов, полученных из корней подвоев вишни. Каллус получали либо из срезанных корешков, либо из целых растений, выращенных в стерильных условиях при микроклонировании побегов вишни. У подвоя вишни Кольт каллус, получен- ный из корней интактных растений, образовывал побеги и эмбриоидо-подобные структуры. Каллусы вишни культивировали на среде Мурасиге—Скуга, допол- ненной БАП, ГК и НУК. Частота образования побегов была выше, чем у анали- зированной параллельно яблони. Растения-регенеранты были размножены че- рез культуру тканей и пересажены в почву. Саженцы растений-регенерантов, полученные из каллусов подвоя вишни по фенотипу, не отличались от исход- ных подвоев. Индукцию соматического эмбриогенеза у сортов вишни (Prunus cerasus L.) наблюдали при культивировании эксплантов на среде Мурасиге—Скуга, до- полненной различными комбинациями ауксинов и цитокининов [49]. Сомати- ческий эмбриогенез в основном происходил, когда использовали комбинацию 2,4-Д и кинетин. Индукция соматического эмбриогенеза также отмечена при добавлении 0,1 мг/л ИМК в индуктивную среду. Использование НУК или 6- БАП уменьшало индукцию соматического эмбриогенеза и увеличивало частоту непрямой регенерации у сортов вишни (Prunus cerasus L.). На сегодняшний день самым надежным способом получения генетически идентичного потомства считается микроклональное размножение плодовых кос- точковых культур пазушными почками по сравнению с соматическим эмбриогене- зом, размножением адвентивными почками и непрямым морфогенезом. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ 1. Полевой В. В., Чиркова Т. В., Лутова Л. А. и др. Практикум по росту и устойчиво- сти растений: Учебное пособие. СПб., 2001. С. 208. 2. Сорокина И. К., Старичкова Н. И., Решетникова Т. Б., Гринь Н. А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей: Учебное пособие. 2002. С. 45. ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 300 3. Чернец А. М., Абраменко Н. М., Стаканова Р. В. Разработка метода длительного хранения in vitro безвирусных клонов плодовых пород и земляники // Тезисы докладов ме- ждународной конференции: Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новоси- бирск, 1988. 4. Романова Н. П., Ульянова Е. К. К вопросу о хранении мериклонов земляники in vitro // Научно-технический бюллетень Научно-исследовательского института растение- водства имени Н. И. Вавилова. Л., 1990. Вып. 204. С. 75–79. 5. Орлова С. Ю. Биологические особенности и селекционная ценность сортов вишни в условиях северо-запада России: Автореф. дис. … канд. биол. наук. СПб., 2002. С. 20. 6. Niino Takao, Tashiro Kazuo, Suzuki Mitsuteru, Ohuchi Susumu, Magoshi Jun, Akihama Tomoya. Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of cherry and sweet cherry by one-step vitrification // Scientia Horticulturae. 1997. Vol. 70. P. 155–163. 7. Высоцкий В. А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение // Сельскохозяйственная биология: Ежеме- сячный научно-теоретический журнал. М., 1983. № 7. С. 42–47. 8. Фаустов В. В., Олешко Е. В, Жаркова И. В., Асадулаев З. М., Шарафутдинов Х. В., Исмаил Х. Микроклональное размножение вишни // Известия ТСХА. М., 1988. Выпуск 5. С. 131–148. 9. Биотехнология растений: культура клеток // Пер. с англ. В. И. Негрука / Под ред. Р. Г. Бутенко. М., 1989. С. 233. 10. Деменко В. И., Трушечкин В. Г. Размножение вишни методом in vitro // Сельско- хозяйственная биология: Ежемесячный научно-теоретический журнал. М., 1983. № 7. С. 51–53. 11. Кашин В. И., Борисова А. А., Приходько Ю. Н., Суркова О. Ю., Упадышев М. Т. и др. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур: Методические указания. М., 2001. С. 97. 12. Шипунова А. А. Клональное микроразмножение плодовых растений: Автореф. дис. … канд. сельскохозяйственных наук. М., 2003. С. 24. 13. Трушечкин В. Г, Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Микроклональное размножение сортов и подвоев косточковых культур: Методические указания. М., 1983. С. 16. 14. Lane W. D. Regeneration of pear plants from shoot meristemtips // Plant Sci. Letters. 1979. Vol. 16. № 2/3. Р. 337–342. 15. Fossard R. A., Bourne R. A. Reducing tissue culture costs for commercial propagation // Tissue culture for horticultural purposes. Acta Hort. 1977. Vol. 78. Р. 37–44. 16. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / Под ред. Е. Н. Джигадло. Орел, 2005. С. 50. 17. Олешко Е. В. Особенности клонального микроразмножения подвоев и сортов вишни: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 1985. С. 15. 18. Хаак Э. Р., Нууст Ю. О. Клональное микроразмножение косточковых культур // Садоводство и виноградарство. М., 1989. № 1. С. 27–29. 19. Дудченко О. П. Регенерация в культуре изолированных меристем сливы // Тези- сы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехно- логия 2». Новосибирск, 1988. С. 358. 20. Корнацкий С. А., Высоцкий В. А., Трушечкин В. Г. Проблемы клонального мик- роразмножения косточковых культур // Достижения в плодоводстве в Нечерноземной зоне РСФСР: Сб. науч. трудов. М., 1991. С. 104–116. 21. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: Ме- тодические рекомендации / Под ред. В. Е. Перфильева. 1996. С. 73. 22. Свитайло А. М., Бондаренко П. Е., Шевчук Н. С. Клональное микроразмноже- ние подвоев и сортов плодовых культур // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 346. Ископаемая мамонтовая кость: проблемы и перспективы изучения… 301 23. Трушечкин В. Г., Высоцкий В. А., Корнацкий С. А. Клональное микроразмноже- ние косточковых культур в системе производства оздоровленного посадочного материала // Тезисы докладов Международной конференции: Биология культивируемых клеток и био- технология 2. Новосибирск. 1988. С. 319-320. 24. Hammatt N., Grant N. J. Micropropagation of mature British wild cherry // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. Vol. 47. P. 103–110. 25. Джигадло М. И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур: Автореф. дис. … канд. сель- скохозяйственных наук. Мичуринск, 2003. С. 25. 26. Ruzic D., Saric M., Cerovic R., Culafic I. Relationship between the concentration of macroelements, their uptake and multiplication of cherry rootstock Gisela 5 in vitro // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2000. Vol. 63. P. 9–14. 27. Корнацкий С. А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе оздоровленного посадочного материала: Автореф. дис. … канд. сельскохозяйственных на- ук. М., 1991. С. 24. 28. Джигадло М. И., Джигадло Е. Н. Размножение вишни методом верхушечных меристем // Улучшение сортимента и прогрессивные приемы возделывания плодовых и ягодных культур: Сборник. Тула, 1988. С. 65–68. 29. Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Совершенствование питательной среды для кло- нального микроразмножения вишни // Агротехника и сортоизучение плодовых культур: Сб. науч. трудов. М., 1985. С. 72–76. 30. Чернец А. М. Влияние минерального питания на интенсивность пролиферации сортов вишни in vitro // Тезисы докладов Международной конференции «Биология культи- вируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 343. 31. Неделчева С., Ганева Д. Размножение in vitro на три вегетативни подложки от рода Prunus // Растен. науки. 1985. Т. 22. № 8. С. 98–104. 32. Boleriola-Lucas C., Millins M. G. Micropropogatiоn of two French prune cultiwars (Prunus domestica L.) // Agronomie. 1984. Vol. 4. № 5. Р. 473–477. 33. Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Использование микропрививок при клональном микроразмножении косточковых культур // Сельскохозяйственная биология. М., 1988. № 4. С. 75–77. 34. Плаксина Т. В. Использование биотехнологии в селекции вишни на Алтае // Мат-лы научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИСС им. М. А. Ли- савенко: Проблемы устойчивого развития садоводства Сибири. Барнаул, 2003. С. 108–110. 35. Высоцкий В. А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные мери- стематические верхушки черной смородины // Плодоводство и ягодоводство нечернозем- ной полосы: Сборник. М. 1979. Том IX. С. 101–107. 36. Лутова Л. А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб., 2003. С. 227. 37. Высоцкий В. А. О генетической стабильности при клональном микроразмноже- нии плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 5. С. 57–63. 38. De Klerk G. -J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects // Biologia Plantarum. Vol. 39. № 1. 1997. Р. 53–66. 39. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Plant regeneration from leaves of sweet and sour cherry cultivars // Scientia Horticulturae. 2002. Vol. 93. P. 235–244. 40. Bhagwat B., David Lane W. In vitro shoot regeneration from leaves of sweet cherry (Prunus avium) ‘Lapins’ and ‘Sweetheart // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands. 2004. Vol. 78. P. 173–181. 41. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Adventitious shoot regeneration in peach [Prunus persica (L.) Batsch] // Plant Cell Reports. 2002. Vol. 20. P. 1011–1016. 42. Takashina T., Nakano H., Kato R. Efficient plant regeneration culture from leaf ex- plants of in vitro-grown sweet cherry // Acta Horticulturae: XXVI International Horticultural Congress: Genetics and Breeding of Tree Fruits and Nuts. Р. 622. ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ 302 43. Burgos L., Alburquerque N. Ethylene inhibitors and low kanamycin concentrations improve adventitious regeneration from apricot leaves // Plant Cell Reports. 2003. Vol. 21. P. 1167–1174. 44. Hammatt N., Grant N. J. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry) // Plant Cell Reports. 1998. Vol. 17. P. 526–530. 45. Grant Neil J., Hammatt Neil. Adventitious shoot development from wild cherry (Prunus avium L.) leaves // New Forests. Netherlands. 2000. Vol. 20. P. 287–295. 46. James D. Ε., Ρоssеу A. J., Μa1hоtrо S. B. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstocks // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1984. Vol. 3. № 4. 47. Тюленев В. М., Нафталиев Н. М., Осипова Л. В., Расторгуев С. Л. Клональное микроразмножение ценных генотипов плодовых культур // Тезисы докладов Международ- ной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология 2». Новосибирск, 1988. С. 320. 48. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner and Watkins R. Plant regeneration from callus tis- sue cultures of the cherry rootstook Colt (Prunus avium × P. pseudocerasus) and the apple root- stook M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Horticultural Science. England. 1984. Vol. 59. № 4. P. 463–467. 49. Tang Haoru, Ren Zhenglong, Krczal Gabi. Somatic embryogenesis and organogene- sis from immature embryo cotyledons of three sour cherry cultivars (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000. Vol. 83. P. 109–126. V. Rogovaia, M. Gvozdev IN VITRO CLONAL MICROPROPAGATION OF STONE-FRUIT CULTURES The review is focused on principal stages and methods of in vitro clonal micro- propagation of stone-fruit cultures. Special emphasis is laid on auxiliary bud propa- gation technique and method of adventitious shoot regeneration from leaf explants of sour cherry, cherry, peach and apricot. Some aspects of plant material testing for virus infections have been reviewed as well as certain problems of genetic stability preservation depending on propagation model.
docslide.net
Микроклональное размножение растений
Содержание
- 1 Общая информация
- 2 Этапы и методы клонального микроразмножения
- 3 Ссылки
- 4 Литература
Общая информацияправить
Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода Однако для большинства видов в первую очередь для древесных пород проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной Это обусловлено следующими причинами:
- не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью дуб, сосна, ель, орехоплодные и др;
- практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;
- не всегда удается получать стандартный посадочный материал возможность накопления и передачи инфекции;
- трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых древесных растений с помощью прививок;
- неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения получение в условиях in vitro в пробирке, неполовым путём растений, генетически идентичных исходному экземпляру В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения 105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных;
- сокращение продолжительности селекционного процесса;
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей Успеху Ж Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений Ж Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума сем орхидные состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал
В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН Под руководством чл-корр РАН, академика РАСХН Бутенко Р Г были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов
Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг
Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время использовалось как объект исследования Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений фенолы, терпены и другие вещества, которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др, а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др
Этапы и методы клонального микроразмноженияправить
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа:
- выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;
- собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов;
- укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре + 2°, + 10 °C;
- выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле
Ссылкиправить
- http://wwwbiotechnologru/
- http://molbiolru/forums/indexphpshowtopic=211150
- http://biofactby/category/mikroklonalnoe-razmnozhenie/
Литератураправить
- Бутенко Р Г Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе, Монография — Москва, ФБК-Пресс, 1999 — 159 с
- Катаева Н В, Бутенко Р Г Клональное микроразмножение растений — М, 1983
- Культура клеток растений / под ред Р Г Бутенко М, 1986
микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение растений Информацию О
Микроклональное размножение растений Комментарии
Микроклональное размножение растенийМикроклональное размножение растений Микроклональное размножение растений Вы просматриваете субъект
Микроклональное размножение растений что, Микроклональное размножение растений кто, Микроклональное размножение растений описание
There are excerpts from wikipedia on this article and video
www.turkaramamotoru.com
