Питательная среда для выращивания растений in vitro. Питательная среда для растений
Питательная среда для выращивания растений in vitro
Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобртения: питательная среда для выращивания растений в культуре тканей содержит макро- и микроэлементы, витамины, 6-бензиламиноцурин, сахарозу и дополнительно гомополисахарид при указанных соотношениях компонентов. 5 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть широко использовано в процессе микроразмножения различных культур.
Известны жидкие питательные среды для культивирования растительных тканей и пробирочных растений. Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является модифицированная жидкая питательная среда с макро- и микроэлементами по Мурасиге и Скугу. Однако жидкая питательная среда не нашла широкого промышленного применения в силу ее некоторых недостатков. Недостатком жидкой среды является то, что при помещении в такую среду эксплантов часто имеет место их гибель вследствие создания неблагоприятных для развития эксплантов анаэробных условий. Для предотвращения гибели обычно применяют мостики из фильтровальной бумаги, однако этот прием значительно снижает технологичность процесса микроразмножения, затрудняет посадку эксплантов, ведет к увеличению материальных и трудовых затрат. Кроме того, использование жидкой питательной среды часто приводит к витрификации тканей эксплантов и появлению сильно оводненных, "стекловидных" и маложизнеспособных побегов. Вместе с тем известна питательная среда, в которую для затвердения вносят агар-агар в концентрации 6-8 г/л. Однако стоимость агара в настоящее время очень высока и его применение при культивировании пробирочных растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства. Кроме того, на указанной среде не всегда удается достичь высоких коэффициентов размножения. Для получения пригодных к укоренению побегов часто применяют дополнительные приемы, например высаживают побеги с целью увеличения их длины на среду с низкой концентрацией цитокининов или прибегают к длительному (3-4 мес.) выдерживанию побегов на среде размножения. Это приводит к увеличению длительности технологического цикла производства посадочного материала и возрастанию затрат. Задачей, на решение которой направлено изобретение, является улучшение приживаемости эксплантов, увеличение числа образуемых почек и побегов, длины побегов, ускорение процесса производства посадочного материала различных культур и снижение стоимости питательной среды. Задача решается тем, что на этапе микроразмножения в питательную среду вносят гомополисахарид при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 1600-1700; калий азотнокислый 1850-1950; кальций хлористый 400-480; магний сернокислый 340-400; калий фосфорнокислый 140-200; железо сернокислое 27-28,6; этилендиаминотетраацетат натрия 37-37,6; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,80-0,86; натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 80-120; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,4-0,6; аскорбиновая кислота 0,8-1,2; 6-бензил- аминопурин 0,8-1,2; сахароза 29000-31000; гомополисахарид 25000-100000; остальное вода до 1 л. Сопоставительный анализ предлагаемого решения с прототипом показывает, что предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что в ее состав входит новый компонент гомополисахарид. Это отличие позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию "Hовизна". Вместе с тем следует сказать, что предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как применение гомополисахарида в качестве компонента питательной среды в процессе микроразмножения совершенно неочевидно для специалистов, работающих в области культуры тканей, и ранее не было использовано, т.е. предложено впервые. Ранее гомополисахарид, являясь побочным продуктом в ряде отраслей легкой промышленности, использовался в агрохимических лабораториях при выполнении ряда анализов, а также в текстильной, полиграфической и медицинской отраслях промышленности. Поскольку все компоненты предложенной питательной среды производятся промышленностью, изобретение вполне может быть реализовано в условиях лабораторий, работающих в области культуры тканей и занимающихся ускоренным размножением растений. Введение гомополисахарида в питательную среду не требует разработки специального оборудования и особых навыков производства работ. Применение гомополисахарида в качестве компонента питательной среды позволяет получить новый эффект увеличивать число образуемых почек и побегов и улучшать развитие побегов. Следовательно, заявляемое решение соответствует критерию "Существенные отличия". Гомополисахарид примерно в 100 раз дешевле агар-агара, что делает его применение экономически выгодным. П р и м е р 1. В питательную среду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл. 1, среда 1). Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают рН 5,5-5,6. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,9 атм (температура 119оС) в течение 15-20 мин. После этого осуществляют высадку эксплантов. Результаты микроразмножения на разных средах через 1 мес. культивирования приведены в табл. 2. На среде с гомополисахаридом по сравнению с жидкой средой отмечается увеличение приживаемости эксплантов на 79,5-94,5% числа почек и побегов в 2,8-3,2 раза, длины побегов в 3,2-6,9 раза. Предлагаемая среда по сравнению с агарсодержащей средой способствовала увеличению числа почек и побегов в 1,4-1,6 раза, длины побегов в 1,3-1,8 раза, тогда как различия по приживаемости эксплантов на этих двух средах были незначительными. На среде с гомополисахаридом отмечено увеличение пригодных для укоренения побегов в 1,2-2,3 раза. Это дает возможность более ранней высадки побегов на среду укоренения, что значительно ускоряет процесс производства посадочного материала. П р и м е р 2. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1, среда 2. Результаты размножения на предлагаемой среде в сравнении с известными приведены в табл. 3. В сравнении с жидкой средой на среде с гомополисахаридом наблюдается увеличение приживаемости на 79,5-100% числа побегов в 2,5-3,6 раза, длины побегов в 4,4-8,5 раза. Среда с гомополисахаридом по сравнению с агаризованной средой обеспечивает увеличение приживаемости эксплантов на 5-10% числа почек и побегов в 1,4-1,7 раза, длины побегов в 1,2-2,3 раза и процента пригодных для укоренения побегов в 1,4-2,6 раза. П р и м е р 3. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1, среда 3. Результаты размножения на разных средах представлены в табл. 4. На среде с гомополисахаридом по сравнению с жидкой средой наблюдается увеличение приживаемости эксплантов на 79,5-100% числа почек и побегов в 2,9-3,3 раза, длины побегов в 3,8-9 раз. В сравнении с агаризованной средой предлагаемая среда способствует увеличению приживаемости эксплантов на 5-10% числа почек и побегов в 1,4-2,3 раза, длины побегов в 1,6-2,2 раза, процента пригодных для укоренения побегов в 1,3-6,5 раза. Полученные данные свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известными средами. Кроме того, среда с гомополисахаридом заметно снижала витрификацию побегов. Так, у малинно-ежевичного гибрида Санберри витрифицированных побегов на жидкой и агаризованной средах составлял соответственно 80 и 61,1% тогда как на среде с гомополисахаридом витрификация отсутствовала. Введение в питательную среду гомополисахарида в концентрациях 10 и 115 г/л оказалось менее эффективным, чем использование его в диапазоне концентраций от 25 до 100 г/л (табл. 5). Таким образом, размножение растений на предложенной питательной среде в сравнении с жидкой и агаризованной средами обеспечивает увеличение приживаемости эксплантов соответственно на 88 и 3% числа почек и побегов в 4,4 и 1,6 раза, длины побегов в 8 и 1,8 раза, пригодных для укоренения побегов в 18 и 1,6 раза. Вместе с тем особо следует подчеркнуть, что даже при отсутствии технического эффекта (по-лучение одинаковых результатов на предложенной и известных средах) применение предложенной среды является экономически выгодным вследствие ее дешевизны.www.findpatent.ru
Методика приготовления питательных сред
Важным фактором, влияющим на успешность размножения того или иного вида растений, является питательная среда, которая должна содержать сбалансированный состав макро- и микроэлементов, углеводов, витаминов, регуляторов роста, аминокислот. Для успешного размножения in vitro в большинстве случаев прописи сред приходится подбирать индивидуально для каждого вида и даже сорта или культивара различных растений.
Некоторые среды, рекомендуемые в литературе, содержат много компонентов, другие более просты. В прописи сред многие авторы включают вещества неопределенного состава: пептон, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, картофельный экстракт, растительные соки, эндосперм кокосового ореха, гомогенат плодовбанана и т. д.
Среды могут быть авизированными или жидкими. К примеру, для пролиферации новообразований и их роста удобнее использовать жидкие среды, прорастание семян и органогенез лучше происходят на твердых питательных средах.
Ткани, выращиваемые в жидких питательных средах, обычно культивируют в роллерах с круговым перемешиванием среды или в шейкерах вибрирующего типа, иногда используют стационарную среду, помещая ткань на мостики из фильтровальной бумаги.
Химический состав среды, ее физические свойства должны соответствовать задачам, поставленным на данном этапе исследования. Основные задачи, которые решает исследователь при размножении растений в асептических условиях, можно сформулировать так: ввести в культуру, размножить (этап мультипликации), укоренить, высадить ex situ с последующей постасептической адаптацией. В соответствии с задачами процесс клонального размножения принято условно разделять на соответствующие этапы.
- На первом этапе часто в состав сред вводят антиоксиданты, предупреждающие активацию гидролитических ферментов и гибель высаженных эксплантов.
- На втором этапе состав среды преимущественно такой же, однако во многих случаях ее обогащают веществами, которые вызывают и многократно усиливают формообразовательные процессы, применяя увеличенные концентрации цитокининов.
- На третьем этапе подбирается состав среды, способствующий укоренению регенерантов; она или вообще не содержит фитогормонов, или содержит лишь небольшие количества ауксинов.
Успех клонального размножения во многом зависит от наличия и концентрации в среде тех или иных элементов минерального питания, органических соединений. Ошибки, допущенные при составлении прописей или в процессе непосредственного приготовления питательных растворов, во многих случаях очень наглядно проявляются на культивируемых растениях (формообразовательные процессы, ритмы развития).
Необходимо четко представлять, из какой климатической зоны происходит растение, знать его биологию и особенности размножения. Сегодня широко известен целый ряд готовых базовых питательных сред для всех этапов микроразмножения растений, однако предпочтительнее индивидуальное покомпонентное приготовление каждого типа питательной среды. Во-первых, это намного дешевле, во-вторых, позволяет своевременно и оперативно реагировать на изменения в поведении культуры in vitro.
Состав питательных средявляется важным фактором, влияющим на рост и развитие растений in vitro. Кроме основных макроэлементов в состав большинства питательных сред входят также и микроэлементы; определенное их количество вносится вместе с макроэлементами. Для приготовления среды отмеривают нужное количество каждого солевого раствора, взвешивают соли железа, сахарозу, вносят те или иные добавки.
При необходимости питательные среды готовят на дистиллированной или бидистиллированной воде. Для удобства в работе и ускорения процесса целесообразно заранее приготовить растворы макро- и микроэлементов, соответственно в 10 и в 100 раз превышающие концентрацию рабочих растворов. Маточные растворы солей хранят в холодильнике при температуре 2-4°С в емкостях из темного стекла не более 6 недель.
Растворы регуляторов роста и витаминов обычно готовят из расчета 1 мг вещества на 1 мл раствора. Цитокинины (6-бензиламинопурин (БАП), зеатин, кинетин) сначала растворяют в не большом количестве 1 н щелочи, ауксины (ИУК, 1-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)) – в 1 капле этанола и затем доводят до нужного объема бидистиллированной водой. Растворы витаминов и фитогормонов также хранят в холодильнике, однако для лучшей сохранности их можно разливать в емкости (эпендорфы) по 3-5 мл (для разового использования) и хранить в морозильной камере. Кинетин плохо растворим. С этой целью можно использовать различные растворители: 1 М раствор НС1 (несколько капель), 50%-й раствор этанола, диметилсульфат или 2%-й раствор NaOH. Гиббереллины растворяют в теплой дистиллированной воде. При этом следует помнить, что эти соединения термонестабильны.
Гумат натрия, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат готовят в день их использования.
Агар лучше расплавить непосредственно перед употреблением в половинном объеме бидистиллированной воды, а затем добавлять к среде.
С учетом того что в растворах катионы простых неорганических солей железа, взаимодействуя с гидроксильными группами, могут выпадать в осадок (Fe203 • 3Н20) и плохо растворяются в средах, pH которых 5,0, железо в прописи питательных сред вводят в виде особых комплексных соединений — хелатов (NaFeЭДТА, FeЭДТА).
Приготовление растворов железа требует особенной тщательности. Раствор NaFeЭДТА готовится в следующей очередности: на аналитических весах взвешивают 5,57 г FeS04 • 7Н20 и 7,45 г NaFeЭДТА. Далее в мерную колбу емкостью 1 л высыпают навески и объем доводят до метки. Раствор FeЭДТА готовят так: 26,1 г этилендиаминтетрауксусной (ЭДТА) кислоты нужно растворить в 268 мл 1 М раствора КОН, после чего добавить 24,9 г FeS04 х 7Н20 и довести объем дистиллированной водой до 1 л. Полученный раствор необходимо аэрировать в течение нескольких последующих часов с целью окисления (Grabowski et al., 1987).
Все манипуляции по приготовлению растворов удобно проводить с помощью магнитной мешалки. Дистиллированная вода должна быть теплой (37-40°С). Полученные таким образом маточные растворы являются комплексными соединениями железа, из которых по мере надобности берут необходимый объем, в зависимости от состава питательной среды. Растворы железа, как и все остальные растворы, должны храниться в холодильнике.
Наиболее часто используются среды с показателем pH от 4,3 до 6,0, т. е. в кислом диапазоне. Иногда, при длительном культивировании некоторых видов, со временем может произойти закисление культуральной среды, что негативно влияет на темпы роста. В этом случае необходимо проверить кислотность отработанной среды, и если сдвиг действительно произошел, то нужно чаще проводить пассажи.
Для коррекции кислотности используются 1 н растворы гидроксида натрия (NaOH) и соляной кислоты (НСl). Корректировку проводят перед автоклавированием во время активного перемешивания среды на магнитной мешалке, постоянно контролируя значения pH и при необходимости добавляя по каплям указанные выше растворы. Корректируя pH, нужно несколько завышать кислотность сред, так как во время автоклавирования происходит небольшой сдвиг pH в кислую сторону (~ на 0,5) вследствие образования сахарных кислот.
Источник: Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro
bio-x.ru
Питательная среда для укоренения растений in vitro
Использование: в сельском хозяйстве и биотехнологии для процессов укоренения и адаптации различных культур. Сущность изобретения: питательная среда для укоренения растений содержит следующие компоненты, мг/л: аммоний азотнокислый 820 - 830; калий азотнокислый 940 - 960; кальций хлористый 210 - 230; магний сернокислый 180 - 190; калий фосфорнокислый 80 - 90; железо сернокислое 13,4 - 13,8; этилендиаминотетраацетат натрия 18,5 - 18,9; борная кислота 3,0 - 3,2; марганец сернокислый 11,0 - 11,4; цинк сернокислый 4,1 - 4,5; калий йодистый 0,40 - 0,44; натрий молибденовокислый 0,11 - 0,15; медь сернокислая 0,011 - 0,015; кобальт хлористый 0,011 - 0,015; миоинозит 40 - 60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2 - 0,3; аскорбиновая кислота 0,4 - 0,6; индолилмасляная кислота 0,5 - 1,5; гидроксипроизводное бензойной кислоты 0,5 - 10,0; сахароза 14000 - 16000; агар 6000 - 8000; вода - остальное до 1 л. Новым в питательной среде является введение в ее состав гидроксипроизводного бензойной кислоты в концентрации 0,5 - 10,0 мг/л. В результате использования предлагаемого изобретения увеличивается процент укоренения побегов, улучшается развитие корневой и надземной систем растений, а также увеличивается приживаемость пробирочных растений после высадки в нестерильные условия. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессе укоренения растений.
Известны питательные среды, в состав которых входят в качестве стимуляторов корнеобразования регуляторы роста ауксиновой и фенольной природы (авт. св. N 1692409, кл. A 01 H 4/00, 16.06.88. Нафталиев Н.М.Х., Тюленев В.М. Способ регенерации растений земляники. Бюл. N 43 от 23.11.91; авт. св. N 1706481, кл. A 01 H 4/00, 15.05.90. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Питательная среда для укоренения побегов ежевики. Бюл. N 3 от 23.01.92). Однако не все регуляторы дают хороший эффект в отношении корнеобразования. Во многих случаях наблюдается сильное каллусообразование, торможение процессов формирования и роста корней, а иногда и отмирание надземной системы. К тому же часто имеет место специфическая сортовая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. Это в свою очередь снижает ценность разработки и приводит к потере ее универсальности для других культур. Лучших результатов по укоренению чаще всего достигают при использовании ИМК. Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является модифицированная питательная среда Мурасиге и Скуга (1962) с добавлением ИМК (Donnelly D.J., Stace-Smith R., Mellor F.C. In vitro culture of three Rubus species. Acta Horticulturae, 1980, N 12, p. 69 - 75). Недостатком указанной среды является то, что она не позволяет достичь максимально возможного уровня укореняемости и развития корневой и надземной систем на этапе укоренения, а также приживаемости после высадки в нестерильные условия. Это приводит к необходимости увеличения продолжительности культивирования на среде укоренения, снижению выхода посадочного материала, удлинению технологического цикла его производства. Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение процента укоренения побегов, улучшение развития корневой и надземной систем различных растений, а также увеличение приживаемости пробирочных растений при высадке в нестерильные условия. Задача решается тем, что в питательную среду для укоренения дополнительно вводят гидроксипроизводное бензойной кислоты при следующих концентрациях компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 820 - 830; калий азотнокислый 940 - 960; кальций хлористый 210 - 230; магний сернокислый 180 - 190; калий фосфорнокислый 80 - 90; железо сернокислое 13,4 - 13,8; этилендиаминотетраацетат натрия 18,5 - 18,9; борная кислота 3,0 - 3,2; марганец сернокислый 11,0 - 11,4; цинк сернокислый 4,1 - 4,5; калий йодистый 0,40 - 0,44; натрий молибденовокислый 0,11 - 0,15; медь сернокислая 0,011 - 0,015; кобальт хлористый 0,011 - 0,015; миоинозит 40 - 60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2 - 0,3; аскорбиновая кислота 0,4 - 0,6; индолилмасляная кислота 0,5 - 1,5; гидроксипроизводное бензойной кислоты 0,5 - 10,0; сахароза 14000 - 16000; агар-агар 6000 - 8000; вода - остальное до 1 л. Кроме того, задача решается и тем, что в качестве гидроксипроизводного бензойной кислоты питательная среда содержит салицилат. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемая питательная среда отличается от известной тем, что в ее состав входит гидроксипроизводное бензойной кислоты. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна". Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный состав среды совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области культуры тканей, и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые. Применение предлагаемой питательной среды позволяет получать новый эффект - увеличивать укореняемость побегов, улучшать развитие корневой и надземной систем растений, повышать их приживаемость в нестерильных условиях. Все компоненты предложенной питательной среды производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений. При этом не требуется разработки специального оборудования. Пример 1. В бидистиллированную воду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл. 1, среда 2). В качестве гидроксипроизводного безнойной кислоты берут салициловую кислоту в концентрации 0,5 мг/л. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5 - 5,7 и при нагревании растворяют навеску агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм (температура 120oC) в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку побегов. Как видно из табл. 2, на разработанной среде отмечается увеличение укореняемости в зависимости от вида растения на 10 - 30% (в 1,2 - 2,0 раза), числа корней в 1,4 - 2,7 раза, длины корней в 1,3 - 4,0 раза по сравнению с прототипом. Высота растений на разработанной среде возросла в 1,1 - 1,4 раза. Наибольший эффект в отношении улучшения корнеообразования предложенная среда давала на таких культурах, как груша, ежевика, малино-ежевичный гибрид. Питательная среда с добавлением салициловой кислоты оказала существенно влияние и на приживаемость растений в нестерильных условиях: она возросла в 1,3 - 5,8 раза по сравнению с известной средой (табл. 3). Пример 2. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрации компонентов указаны в табл. 1, среда 3. В качестве гидроксипроизводного бензойной кислоты используют салициловую кислоту в концентрации 5 мг/л. Предложенная среда обеспечивает увеличение укореняемости побегов в 1,4 - 2,7 раза, их длины в 1,2 - 12,0 раз, высоты растений в 1,1 - 1,4 раза, приживаемости в нестерильных условиях в 1,1 - 5,9 раза в сравнении с прототипом. Пример 3. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрации компонентов среды указаны в табл. 1, среда 4. Как гидроксипроизводное бензойной кислоты берут салициловую кислоту в концентрации 10 мг/л. Разработанная среда способствует увеличению укореняемости в 1,3 - 2,7 раза, числа и длины корней соответственно в 1,3 - 4,3 и 1,8 - 9,8 раза, высоты растений в 1,1 - 1,4 раза, приживаемости в 1,1 - 6,2 раза по сравнению с известной средой. Более низкие (см. среду 1, табл. 2 и 3) или высокие концентрации гидроксипроизводного бензойной кислоты (см. среду 5, табл. 2 и 3) ухудшали развитие растений по сравнению с предложенным диапазоном концентраций, а следовательно, были менее эффективными. Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известной средой. В среднем разработанная среда обеспечивает увеличение процента укоренения в 1,7 раза, числа корней в 2,5 раза, длины корней в 3,3 раза, высоты растений в 1,2 раза, а их приживаемости в нестерильных условиях в 2,6 раза по сравнению со средой-прототипом. В лучших вариантах число корней возрастало в 4,5 раза, их длина - в 12 раз, а приживаемость в нестерильных условиях - в 6,2 раза. Следует особо подчеркнуть универсальный характер предложенной среды, ее пригодность для укоренения различных видов растений.Формула изобретения
1. Питательная среда для укоренения растений in vitro, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, индолилмасляную кислоту, сахарозу, агар, воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гидроксипроизводное бензойной кислоты при следующем соотношении компонентов, мг/л: Аммоний азотнокислый - 820 - 830 Калий азотнокислый - 940 - 960 Кальций хлористый - 210 - 230 Магний сернокислый - 180 - 190 Калий фосфорнокислый - 80 - 90 Железо сернокислое - 13,4 - 13,8 Этилендиаминотетраацетат натрия - 18,5 - 18,9 Борная кислота - 3,0 - 3,2 Марганец сернокислый - 11,0 - 11,4 Цинк сернокислый - 4,1 - 4,5 Калий йодистый - 0,40 - 0,44 Натрий молибденовокислый - 0,11 - 0,15 Медь сернокислая - 0,011 - 0,015 Кобальт хлористый - 0,011 - 0,015 Миоинозит - 40 - 60 Тиамин - 0,2 - 0,3 Пиридоксин - 0,2 - 0,3 Никотиновая кислота - 0,2 - 0,3 Аскорбиновая кислота - 0,4 - 0,6 Индолилмасляная кислота - 0,5 - 1,5 Гидроксипроизводное бензойной кислоты - 0,5 - 10,0 Сахароза - 14000 - 16000 Агар - 6000 - 8000 Вода - До 1 л 2. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве гидроксипроизводного бензойной кислоты она содержит салицилат. 3. Среда по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве салицилата она содержит салициловую кислоту.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2www.findpatent.ru
 Микроклонирование - это реальная альтернатива среди традиционных методов размножения растений. Оно позволяет получать взрослые растения из малых частей, т.к. часть стебля, сегмент листа или корня, выращенные в асептическом (отсутствие микроорганизмов) контейнере с возможностью полного контроля среды. Получаемые растения полностью идентичны растениям - родителям. Выращивание «in vitro» производится в лабораторных условиях, но при соблюдении некоторых требований данные эксперименты могут быть успешно осуществлены у вас дома.
Оборудование, необходимое для выращивания культуры «in vitro»:1. Стерильное помещение, в котором будут производиться все операции. Идеально может подойти аквариум 50/40/40.2. Духовой шкаф для стерилизации посуды, инструмента и т.д.3. Стеклянные или пластиковые контейнеры с крышками, обладающие достаточной термостойкостью4. Скальпель и шипцы5. Офисная бумага формата А46. Спиртовка7. Аэрозоль, содержащий 70% спирта для обработки поверхностей8. Хлоросодержащее дезинфицирующее средсто для обработки растений9. Дезинфицирующее средство для рук10. Питательная среда для растенийПриготовление питательной средыТрадиционно в роли питательной среды выступает среда MS (Мурасиге-Скуга), которую можно приобрести в некоторых химических компаниях. Но также можно самостоятельно приготовить подходящую питательную среду. Все составляющие широко доступны:1. 2 чашки кипяченной воды2. 1 часть сахарного песка3. Разведенное удобрение ( половина от нормы NPK 10/10/10 в 1 литре воды)4. Таблетка Иноситола 250 мг.5. ½ таблетки мультивитамина ( с тиамином)6. 4 части агараЭто базовая среда. Для приготовления среды в целях мультипликации и укоренения необходимо добавить ½ часть кокосового молока и ½ чайной ложки солода. В итоге на нужно получить среду с Ph в диапазоне от 5 до 6. Если то не так, то необходимо добиться этих показателей путем подкисления (лимонная кислота) или подщелачивания (пищевая сода). Смешайте все перечисленные компоненты в кастрюле и варите на медленном огне до растворения агара. Затем разлейте получившуюся жидкость по подготовленным емкостям (примерно по 2 см.). Закройте емкости и поместите их в духовой шкаф на 15 минут для стерилизации.Стерилизация инструментов и другого оборудованияЩипцы и скальпели могут стерилизоваться, будучи обернутыми в фольгу в духовом шкафу в течение 15 минут. Также их можно стерилизовать в хлорной жидкости или в спирте с последующим прокаливанием над огнем.Стерильная вода необходима для того, чтобы ополаскивать растение, а стерильная бумага для того, чтобы его можно было просушить.Вода может стерилизоваться в стеклянных емкостях. Бумага в бумажном пакете стерилизуется паром в духовом шкафу над водой. Стерлизация растительного материала Весь материал необходимо стерилизовать в хлоросодержащей жидкости (подойдет отбеливатель)+ 3/4 воды + 1 часть моющего средства, которое снизит поверхностное натяжение ). Стерилизация занимает 10-20 минут. Производите периодическое взбалтывание. Этот процесс убьет бактерии и грибы. При более длительном отмачивание может произойти отмирание растительной ткани, будьте внимательны. Промойте растение дважды в стерильной воде. Операции в стерильном помещение К последующим операциям необходимо подойти с особым вниманием, чтобы не позволить микроорганизмам помешать вашей работе: 1. Спрячьте волосы, засучите рукава и удалите часы и другие драгоценности. Вымойте свои руки дезинфицирующим средством, подходящим для кожи. Наденьте стерильные перчатки. 2. Стерилизуйте внутреннюю часть аквариума спиртовым аэрозолем и вытрите стерильной бумагой. 3. Расставьте все инструменты которые понадобятся вам в работе.
МультипликацияВ течение месяца выжившие растения заметно выросли и их необходимо пересадить на среду, содержащую кокосовое молоко. Кокосовое молоко содержит вещества, способствующие быстрой сегментации и мультипликации растения. При пересадке растения необходимо повторить все вышеперечисленные операции, за исключением обработки растения хлоросодержащей жидкостью. Операции проводятся в стерильном аквариуме на влажной стерильной бумаге. Влажность необходима для растения, которое является достаточно мягким и может быстро высохнуть.Формирование корняКак только растение достигло как минимум 2 см в высоту можно начать процесс укоренения. Растение по привычной схеме пересаживается в среду из кокосового молока и солода. судно культуры. Корни формируются в течение двух - четырех недель.Пересадка в почву (акклиматизация)На данном этапе подготовленные горшки заполняют стерильной почвенной смесью без добавления удобрений. В почве делают небольшое углубление.С помощью пинцета достают ратение из контейнера и отмывают теплой водой остатки агара с корней. Растение помещают в углубление, увлажняют из распылителя и накрывают горшок прозрачным колпаком. Постепенно приучайте растение к окружающей среде, периодически снимая колпак. Акклиматизация происходит в течение 4-6 недель. Затем переходят к привычном методам выращивания.По материалам Horticultural Science GroupDepartment of Agronomy and Soil Science {social}
|
4. Работая в аквариуме, возьмите стерильный растительный материал из емкости с помощью щипцов. Стерилизуйте свои инструменты, опуская их в алкоголь между каждой операцией. Допускается использование стебля с небольшими листочками, если листья большие их следует укоротить. В каждый контейнер помещают по одной части матерала. Затем контейнеры плотно закрывают крышкой и ставят в слегка освещенное место на месяц. В течение этого времени некоторые растения могут погибнуть из-за обработки хлором, некоторые будут заражены микроорганизмами, а некоторые начнут быстро расти в стерильных контейнерах. От зараженных растений необходимо избавиться.www.entheoworld.ru
Типы питательных сред и обзор их составов
В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые (агаризованные), так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой – агаризованный, верхний – жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.
Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На микроклональное размножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При размножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге–Скуга (MS), которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Вопрос оптимального соотношения Nh5 - NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах микроклонального размножения.
Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са++, Мg++. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.
Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).
В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.
Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологиче-ские катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.
Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.
Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).
Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.
Ауксины: ИУК – индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-масляная кислота, НУК – нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.
Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. Иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
Таблица 1
Похожие статьи:
poznayka.org
Питательная среда для выращивания растений
Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда для выращивания растений содержит источники азота, фосфора, калия, магния и дополнительно содержит калий хлористый, натрий хлористый, кальций хлористый, кальций сернокислый двухводный, кальций углекислый, а в качестве источников азота, фосфора и калия указанные соотношения различных солей. 4 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к обоснованию состава и использованию питательной среды для выращивания растений в теплицах и водных растворах.
Известен состав питательной среды, включающий ингредиенты NPK, Са2+, Mg2+, Сl-, SO42-, h3O [1] Для выращивания растений в теплицах широко применяют состав питательной среды, включающий основные элементы питания NPK, Са2+, Мg2+, h3O [2-4] Однако указанные питательные среды обладают слабой буферностью в отношении изменения рН, что часто не позволяет заменить одни соли другими, в особенности двухзамещенные фосфаты на однозамещенные, характеризуются постоянной исходной концентрацией в течение всего вегетационного периода, что не всегда является оптимальным для роста и развития растений, не содержат некоторых ингредиентов, способных в оптимальных количествах повышать урожайность возделываемых культур. Цель изобретения повышение урожайности зерновых культур и увеличение их коэффициента размножения. Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая питательная среда, содержащая соли фосфора, калия, азота, натрий хлористый, калий хлористый, кальций сернокислый, кальций углекислый, создается расчетным путем с величиной рН, концентрацией ионов и их составом, приближающимся к составу жидкой фазы (почвенных растворов) черноземных и каштановых почв, отличается стабильностью рН (около 7), что не требует его ежедневной корректировки, дополнительно содержит натрий и калий хлористые, кальций хлористый и углекислый, кальций сернокислый, в качестве источников азота, фосфора и калия содержит взаимозаменяемые смеси их солей, обеспечивающие постоянство азотно-фосфорно-калийного питания, что облегчает применение среды на практике. Высокое содержание ионов кальция способствует образованию прочной соломы. Растения практически не болеют корневыми гнилями в отличие от использования ранее известных растворов. Пример 1. Для выращивания селекционного материала зерновых культур в теплице следует пользоваться до фазы кущения и от фазы молочно-восковой спелости до полной питательной средой низкой концентрации. Она иммитирует жидкую фазу почв 38%-ной влажности. От фазы кущения до фазы молочно-восковой спелости применяют среду более высокой концентрации (вариант 2, табл.1). В растворы добавляются микроэлементы. 1 вариант концентрации предлагаемого раствора используется до фазы кущения и от фазы молочно-восковой спелости до полной, 2 вариант- от фазы кущения до молочной спелости. Такое использование питательного раствора и изменение его количественного состава связано: 1) с широким варьированием состава почвенного раствора в наиболее увлажненный весенний период (м-экв/л): НСО3--5,3-11,6; Cl--2,6-5,7; SO42--6,7-14,7; Ca2+-9,5-21; Mg2+-4,4-9,7; Na+-0,8-l,8, 2) с варьированием содержания элементов питания (мг/100г почвы): P2O5- 0,05-30; NO3--l,0-200; K2O-3,5-80, 3) с постепенным снижением влажности почв до 10-15% от веса почвы, а значит и увеличением концентрации почвенных растворов в несколько раз. Для расчета количеств P2O5, N и K2O в питательной среде исходили из содержания в почве подвижных форм этих элементов соответственно 4,0 и 5,4 мг/100 г почвы, из содержания K2O в почвенном растворе 6,0 м-экв/л. Для облегчения применения среды на практике в зависимости от имеющихся реактивов предлагаемый раствор используют в виде постоянной и меняющейся частей. Меняющаяся часть состава среды, обеспечивающая постоянство азотно-фосфорно-калийного питания, может состоять из ряда составов, содержащих одинаковое количество NPK (N-0,191-0,420 г/л; Р-0,059-0,129 г/л; К-0,175-0,385 г/л) (табл. 2,3). Сопоставимый анализ с прототипом (табл.1,2) позволяет сделать вывод, что заявляемый состав питательной среды и прототип содержат источники азота, фосфора, калия и магния и отличается от известного введением новых компонентов, а именно: карбоната кальция, гипса, что стабилизирует величину рН его и позволяет использовать как одно-, так и двухзамещенные соли фосфорной кислоты (табл. 3), отличается концентрацией компонентов для использования в разные фазы развития растений. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна". Стабильность величины рН питательного раствора позволяет уменьшить затраты труда на корректировку этой величины. На предложенной среде растения практически не болеют корневыми гнилями. Увеличение концентрации питательной среды от фазы кущения до молочно-восковой спелости обеспечивает более интенсивное поглощение элементов питания в наиболее напряженные фазы роста и развития растений. При использовании предложенного состава питательной среды по сравнению с раствором Чеснокова и Базыриной урожай яровой мягкой пшеницы на 40-80% выше (табл. 4). Твердая пшеница практически не давала урожая на ранее применяемой среде. На предлагаемой среде рост и развитие твердой пшеницы нормальные (рис.1). Повышенные уcтойчивость растений к корневым гнилям, коэффициент размножения, урожайность, стабильная величина рН среды позволяют при применении предлагаемого раствора уменьшить затраты труда, увеличить выход продукции с 1м2 на 30-80% Питательная среда предлагается к использованию в гидропонных овощных, цветочных и селекционных теплицах. ТТТ1 ТТТ2Формула изобретения
Питательная среда для выращивания растений, содержащая источники азота, фосфора, калия, магния, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калий хлористый, натрий хлористый, кальций хлористый, кальций серно-кислый двухводный, кальций углекислый, в качестве источника магниямагний серно-кислый безводный или магний серно-кислый семиводный, а в качестве источников азота, фосфора и калия содержит смесь кальция азотно-кислого или кальция азотно-кислого четырехводного, или кальция азотно-кислого десятиводного с калием фосфорно-кислым двухзамещенным, или калием фосфорно-кислым двухзамещенным трехводным, или смесь калия фосфорно-кислого однозамещенного, или калия фосфорно-кислого однозамещенного двухводного с калием азотно-кислым, кальцием азотно-кислым или кальцием азотно-кислым четырехводным или кальцием азотно-кислым десятиводным, или смесь кальция фосфорно-кислого двухзамещенного, или кальция фосфорно-кислого двухзамещенного двухводного с калием азотно-кислым, кальцием азотно-кислым или кальцием азотно-кислым четырехводным, или кальцием азотно-кислым десятиводным, или смесь кальция фосфорно-кислого однозамещенного, или кальция фосфорно-кислого одноднозамещенного одноводного, или кальция фосфорно-кислого однозамещенного в составе суперфосфата с калием азотно-кислым, кальцием азотно-кислым или кальцием азотно-кислым четырехводным, или кальцием азотно-кислым десятиводным, или смесь кальция форфорно-кислого однозамещенного, или кальция фосфорно-кислого однозамещенного одноводного, или кальция однозамещеного в составе суперфосфата с калием азотно-кислым и аммонием азотно-кислым, или смесь аммония азотно-кислого с калием фосфорно-кислым двухзамещенным, или калием фосфорно-кислым двухзамещенным трехводным, или смесь калия фосфорно-кислого однозамещенного с калием азотно-кислым и аммонием азотно-кислым, или смесь кальция фосфорно-кислого двухзамещенного, или кальция фосфорно-кислого двухзамещенного двухводного с калием азотно-кислым и аммонием азотно-кислым при следующем соотношении компонентов, г/л калий хлористый 0,029-0,064 натрии хлористый 0,047-0,103 кальций хлористый безводный 0,078-0,172 магний серно-кислый 0,264-0,581 или магний серно-кислый семиводный 0,540-1,190 кальций серно-кислый двухводный 0,175-0,385 кальций углекислый 0,265-0,583 смесь: кальций азотно-кислый 1,123-2,471 или кальций азотно-кислый четырехводный 1,610-3,540 или кальций азотно-кислый десятиводный 2,350-5,170 калий фосфорно-кислый двухзамещенный 0,330-0,730 или калий фосфорно-кислый двухзамещенный трехводный 0,430-0,946 или смесь: калий фосфорно-кислый однозамещенный 0,254-0,560 или калий фосфорно-кислый однозамещенный двухводный 0,322-0,708 калий азотно-кислый 0,195-0,429 кальций азотно-кислый 0,960-2,112 или кальций азотно-кислый четырехводный 1,380-3,036 или кальций азотно-кислый десятиводный 2,010-4,422 или смесь: кальций фосфорно-кислый двухзамещенный 0,254-0,560 или кальций фосфорно-кислый двухзамещенный двухводный 0,322-0,708 калий азотно-кислый 0,422-0,930 кальций азотно-кислый 0,779-1,714 или кальций азотно-кислый четырехводный 1,121-2,466 или кальций азотно-кислый десятиводный 1,634-3,595 или смесь: кальций фосфорно-кислый однозамещенный 0,220-0,484 или кальций фосфорно-кислый однозамещенный одноводный 0,236-0,519 кальций фосфорно-кислый однозамещенный в составе суперфосфата 0,290-0,538 калий азотно-кислый 0,422-0,930 кальций азотно-кислый четырехводный 1,121-2,466 или кальций азотно-кислый десятиводный 1,634-3,595 или смесь: кальций фосфорно-кислый однозамещенный 0,220-0,484 или кальций фосфорно-кислый однозамещенный одноводный 0,236-0,519 или кальций фосфорно-кислый однозамещенный в составе суперфосфата 0,290-0,645 калий азотно-кислый 0,422-0,928 аммоний азотно-кислый 0,380-0,836 или смесь: аммоний азотно-кислый 0,545-1,200 калий фосфорно-кислый двухзамещенный 0,330-0,730 или калий фосфорно-кислый двухзамещенный трехводный 0,430-0,950 или смесь: калий фосфорно-кислый однозамещенный 0,254-0,559 калий азотно-кислый 0,196-0,428 аммоний азотно-кислый 0,465-1,024 или смесь: кальций фосфорно-кислый однозамещенный 0,254-0,559 или кальций фосфорно-кислый двухзамещенный двухводный 0,322-0,708 калий азотно-кислый 0,422-0,940 аммоний азотно-кислый 0,380-0,836РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4www.findpatent.ru
Питательная среда для микроразмножения растений
Использование: в сельском хозяйстве и биотехнологии для микроразмножения различных растений. Сущность изобретения: для увеличения числа образуемых почек и побегов, длины побегов и числа листьев питательная среда содержит следующие компоненты, мг/л: аммоний азотнокислый 1600-1700, калий азотнокислый 1850-1950, кальций хлористый 420-460, магний сернокислый 350-390, калий фосфорнокислый 160-180, железо сернокислое 27,6-28,0, этилендиаминотетраацетат натрия 37,0-37,6, борная кислота 6,0-6,4, марганец сернокислый 22,0-22,6, цинк сернокислый 8,3-8,9, калий йодистый 0,80-0,86, натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03, кобальт хлористый 0,02-0,03, миоинозит 80-120, тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,4-0,6, аскорбиновая кислота 0,8-1,2, 6-бензиламинопурин 0,8-1,2, этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты 0,001-0,1, сахароза 28000-32000, агар 6000-8000, остальное - вода до 1 л. Новым в питательной среде является введение в ее состав этиленпродуцента на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты в концентрации 0,001-0,1 мг/л. 2 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессе микроразмножения различных растений.
Известны питательные среды, включающие в свой состав макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу (1962), витамины, регуляторы роста, сахарозу и агар-агар [1, 2] Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является модифицированная питательная среда Мурасиге и Скуга (1962) с добавлением тиамина, пиридоксина, никотиновой и аскорбиновой кислот, миоинозита, 6-бензиламинопурина, сахарозы и агар-агара [3] Однако при культивировании растений на указанной среде удается достичь недостаточно высокого коэффициента размножения и показателей развития надземной системы. Это приводит к снижению выхода посадочного материала, удлинению технологического цикла производства, а следовательно, к возрастанию материальных и трудовых затрат. Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение числа образуемых почек и побегов, длины побегов и числа листьев. Задача решается тем, что в питательную среду для размножения дополнительно вводят этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты при следующих концентрациях компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 1600-1700; калий азотнокислый 1850-1950; кальций хлористый 420-460; магний сернокислый 350-390; калий фосфорнокислый 160-180; железо сернокислое 27,6-28,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,0-37,6; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,3-8,9; калий йодистый 0,80-0,86; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая о,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 80-120; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,4-0,6; аскорбиновая кислота 0,8-1,2; 6-бензиламинопурин 0,8-1,2; этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты 0,001-0,1; сахароза 28000-32000; агар 6000-8000; остальное вода до 1 л. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемая питательная среда отличается от известной тем, что в ее состав входит этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна". Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный состав среды совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области культуры тканей, и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые. Вместе с тем следует отметить, что ранее этиленпродуценты применялись рядом исследователей при культивировании каллусных тканей и получении клеточных суспензий [4, 5] однако в процессе микроразмножения пробирочных растений с получением соответствующих эффектов не использовались. Кроме того, концентрация этиленпродуцента в первом случае [4] составляла 1 мг/л, во втором [5] 10 мг/л, то есть находилась за пределами заявляемого диапазона концентраций. Применение предлагаемой питательной среды позволяет получать новый эффект повышать коэффициент размножения и улучшать развитие надземной системы. Все компоненты предложенной питательной среды производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений. При этом не требуется разработки специального оборудования. Пример 1. В бидистиллированную воду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл.1, среда 2). Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5-5,7 и при нагревании растворяют навеску агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм (температура 120oC) в течение 18-10 мин, после чего осуществляют высадку эксплантов. Как видно из таблицы 2, на разработанной среде отмечается увеличение числа почек и побегов в зависимости от вида растений в 1,4-1,5 раза, длины побегов в 1,5-2,4 раза, числа листьев в 1,2-1,8 раза по сравнению с прототипом. Пример 2. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрации компонентов указаны в таблице, 1 среда 3. Предложенная среда обеспечивает увеличение числа почек и побегов в 1,5 раза, длины побегов в 1,6-2,6 раза, числа листьев в 1,3-1,7 раза по сравнению с известной средой. Пример 3. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрации компонентов указаны в таблице 1, среда 4. Предложенная среда способствует увеличению числа почек и побегов в 1,2-1,7 раза, длины побегов в 1,3-2,2 раза, числа листьев в 1,5-1,7 раза в сравнении с прототипом. Следует отметить, что как более высокие концентрации этиленпродуцента (среда 5, табл.2), так и более низкие (среда 1, табл.2) по сравнению с предложенным диапазоном концентраций ухудшают развитие эксплантов на среде размножения, а следовательно, менее эффективны. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении со средой Мурасиге и Скуга. В среднем питательная среда с этиленпродуцентом на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты обеспечивает увеличение числа почек и побегов в 1,4-1,6 раза, длины побегов в 1,5-2,4 раза, числа листьев в 1,3-1,7 раза по сравнению со средой-прототипом. Вместе с тем в лучших вариантах отмечали возрастание коэффициента размножения в 1,7 раза, длины побегов в 2,6 раза, числа листьев в 1,8 раза. Это способствует увеличению выхода посадочного материала, а также сокращает время, необходимое для проведения технологического цикла производства. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении со средой Мурасиге и Скуга. В среднем питательная среда с этиленпродуцентом на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты обеспечивает увеличение числа почек и побегов в 1,4-1,6 раза, длины побегов в 1,5-2,4 раза, числа листьев в 1,3-1,7 раза по сравнению со средой-прототипом. Вместе с тем в лучших вариантах отмечали возрастание коэффициента размножения в 1,7 раза, длины побегов в 2,6 раза, числа листьев в 1,8 раза. Это способствует увеличению выхода посадочного материала, а также сокращает время, необходимое для проведения технологического цикла производства. Источники информации 1. Finne A.Micropropagation of Rubus spp.//J.of Agricultural Science in Finland. -1986.-V.58.-P.193-196. 2. Sobczykiewicz D. Mass production of raspberry plants by meristem culture// Acta Horticulturae. 1987.-V.2.-N 212.-P.607-609. 3. Упадышев М.Т. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение ежевики и малины черной // Сб. науч. тр. Новое в ягодоводстве Нечерноземья. М. 1990.-С. 56-65. прототип. 4. Keynolds T. L. Etylene effects of pollen callus formation and oryanagenesis in anther cultures of Solanum cardinense L.// Plant Sci.-1989.-V. 61.-N 1. Р.131-136. 5. Roustan Y.-P. Lateke A. Fallof Y. Control of carrot somatic embryogenesis by AgNP3, an inhibitor of ethylene action: effect on arginine decarboxulase activity//Plant Sci. 1990. v. 67. N1. P. 89 - 95.Формула изобретения
Питательная среда для микроразмножения растений, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты при следующем соотношении компонентов, мг/л: Аммоний азотнокислый 1600 1700 Калий азотнокислый 1850 1950 Кальций хлористый 420 460 Магний сернокислый 350 390 Калий фосфорнокислый 160 180 Железо сернокислое 27,6 28,0 Этилендиаминотетраацетат натрия 37,0 37,6 Борная кислота 6,0 6,4 Марганец сернокислый 22,0 22,6 Цинк сернокислый 8,3 8,9 Калий йодистый 0,80 0,86 Натрий молибденовокислый 0,2 0,3 Медь сернокислая 0,02 0,03 Кобальт хлористый 0,02 0,03 Миоинозит 80 120 Тиамин 0,4 0,6 Пиридоксин 0,4 0,6 Никотиновая кислота 0,4 0,6 Аскорбиновая кислота 0,8 1,2 6-Бензиламинопурин 0,8 1,2 Этиленпродуцент на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты 0,001 0,1 Сахароза 28000 32000 Агар 6000 8000 Вода До 1 лвРИСУНКИ
Рисунок 1www.findpatent.ru
