Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений. Культуры клеток и тканей растений обеспечивают
Биология для студентов - 02. Этапы развития метода культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений
В развитии метода культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений можно выделить следующие основные этапы:
1892 -1902 гг. Этот период связан с работами немецких ученых X. Вёхтинга, К. Рехингера и Г. Габерландта. Они пытались выращивать in vitro изолированные из растений кусочки ткани на растворах сахарозы, однако длительно растущих культур не получили. В то же время X. Вёхтинг показал, что полярность присуща не только органам растений, но и самым маленьким фрагментам ткани, и предположил, что она является свойством отдельной клетки.К. Рехингер получил каллусную ткань из сегментов стебля тополя, корня одуванчика, свеклы и других культур и определил минимальный размер фрагмента (1,5 мм), способного образовывать каллус. Г. Габерландт пытался культивировать in vitro эпидермис, клетки тычиночных волосков традесканции и полисадной паренхимы листа. Его расчет на то, что хлорофиллоносные клетки паренхимы обеспечат себя органическими веществами за счет фотосинтеза, оказался ошибочным. Он выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовать свой потенциал развития - образовать целый организм. Таким образом, на основании работ данного этапа были выдвинуты следующие идеи:
- полярность свойственна не только органам растения, но и отдельной клетке;
- любая живая клетка растения тотипотентна.
1907-1930 гг. В этот период были достигнуты существенные успехи в культивировании животных тканей на питательных средах природного происхождения:
- плазма крови,
- зародышевая жидкость.
Работы Р. Гаррисона, А. Каррела и др. Но, когда в 1927 г. X. Чех и С. Праг попытались по аналогии вырастить изолированные ткани растения на растительных экстрактах, их постигла неудача. Причина ее заключалась в том, что в опытах использовались мало пригодные для проявления ростовой активности ткани высших растений. Общей тенденцией в те годы была оптимизация состава питательных сред с целью обеспечить длительное существование in vitro изолированных клеток и тканей растений. В 1922 г. В. Роббинс и независимо от него В. Котте осуществили культивирование на синтетической питательной среде меристем кончиков корня томата и кукурузы, тем самым положив начало методу культуры изолированных органов растений. Корни некоторое время росли, но не размножались, а как их поддерживать длительное время в культуре, ученые не знали. 1932-1939 гг. связаны с именами двух исследователей: американца Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они повторили опыты В. Роббинса и В. Когте, показав, что изолированные корни могут расти на питательной среде неограниченно долго, если их кончики периодически пересаживать на свежую питательную среду. Успех работ Ф. Уайта и Р, Готре был обусловлен удачным выбором объектов исследования:
- каллусные ткани древесных растений (камбиального происхождения) и запасающей паренхимы,
- ткани растительных опухолей и корневые меристемы.
Они установили, что ткани камбиального и паренхимного происхождения, а также опухолевые можно длительно поддерживать in vitro, если их периодически субкультивировать. Ф. Уайт и Р. Готре по праву считаются основоположниками метода культуры тканей и клеток растений.
1940-1960-е гг. В вышедшей в 1959 г. монографии Р. Готре уже упоминалось 142 вида растений, ткани которых выращиваются in vitro. В этот период для многих культур были разработаны специальные питательные среды, изучено значение макро- и микроэлементов для поддержания ростовой активности каллусной ткани, выявлена потребность культур в витаминах и стимуляторах роста.
Ф. Скуг и С. Миллер в 1955 г. при изучении способности к делению и образованию каллуса в клетках сердцевинной паренхимы стебля табака открыли новый класс фитогормонов - цитокинины. Они показали, что кинетин в комбинации с ИУК стимулировал деление клеток сердцевинной паренхимы, лишенной камбия и проводящих пучков. Клетки на среде с ИУК, но без кинетина не делились. В зависимости от соотношения и концентраций регуляторов роста можно было:
- усиливать деление клеток эксплантата (фрагмента ткани или органа, инкубируемого на питательной среде или используемого для получения первичного каллуса),
- поддерживать рост каллусной ткани,
- индуцировать морфогенез.
В то время исследовались также натуральные экстракты - эндосперм кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений - по их способности поддерживать неорганизованный клеточный рост и стимулировать процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в каллусной культуре и суспензиях клеток (Ф. Стюард, 1962). Были разработаны:
- метод получения и выращивания больших количеств клеточных суспензий,
- метод культивирования отдельной, выделенной из суспензии, клетки, деление которой индуцировали с помощью ткани-«няньки» (JI. Джонс, 1960).
1960-1973 гг. Этот период связан с разработкой Е. Кокингом (1960) метода получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов и исследованием их физиологии. Стало возможным вывести клетку из «деревянной тюрьмы» (по образному выражению А. Галстона) и манипулировать с ней. Были найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу (И. Такебе, 1971). Протопласты были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем их слияния, для введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. На соматических гибридах изучалось поведение ядерного и цитоплазматических геномов в гибридных клеточных линиях.
В этот период разработан метод культуры апикальных меристем, позволяющий быстро и эффективно размножать растения (Дж. Морсль, 1959; Р. Г. Бутенко, 1960-1964). Полученные растения часто не содержали вирусных, бактериальных и микоплазменных инфекций. Была открыта индукция андроге- неза при культивировании изолированных пыльников, а андрогенез использо¬ван для получения гаплоидных и дигаплоидных линий. Обнаружено явление сомаклональной изменчивости, получены и изучены растения-регенеранты табака - сомаклональные варианты (СКВ) исходной формы. В рассмотренный период совершенствовались методы и аппаратура для культивирования суспензии клеток.
1974-1990-е гг. Происходит развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов и создание технологий на их основе. У. Циммерманом в 1974 году был разработан метод электрослияния изолированных протопластов. На основе методов гибридизации соматических клеток, мутагенеза и клеточной селекции, получения СКВ и гаплоидов создано множество новых форм и сортов сельскохозяйственных растений. С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе плазмид, разнообразных способов введения генов в клетки стало возможным и приобрело массовый характер получение трансгенных растений. В настоящее время делаются попытки создать симбиотические системы гетеротрофных эукариотических клеток высших растений с азотфиксирующими фототрофными цианобактериями.
vseobiology.ru
Культуры клеток и тканей растений и животных — МегаЛекции
Лекция № 8
Несмотря на успехи, достигнутые в области использования различных микроорганизмов, микробная биотехнология имеет целый ряд существенных недостатков. Прежде всего это невозможность получения целых классов жизненно важных для человека соединений, таких как алкалоиды, стероиды, многие полифенолы и терпеноиды, поскольку в природных сообществах микроорганизмов не найдены продуценты этих веществ. По той же причине ограничены и возможности биотрансформационных процессов с участием микроорганизмов.
Другим объектом биотехнологического производства, помимо одноклеточных микроорганизмов могут выступать специально культивируемые клетки и ткани высших растений и животных. Эта область биотехнологии стала развиваться относительно недавно, последние 30-40 лет. Однако идеи и первые попытки их реализации возникли еще в конце XIX века.
В конце XIX - начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтровальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой интерес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили развитие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сегмента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусочках ткани тоньше 1,5-2,0 мм клетки не делились. Хаберланд впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности клеток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способности каждой растительной клетки давать начало целому организму.
Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В. Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончиков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.
В 1907г. Р.Гаррисон открыл новый путь изучения живой клетки многоклеточных организмов, показав, что клетки зачатка нервной системы зародыша лягушки в капле лимфы остаются живыми, дифференцируются, из них вырастают нервные волокна. Этим было положено начало созданию метода культуры животных клеток, который, главным образом благодаря работам Карреля, послужил мощным толчком к дальнейшему развитию цитологии и биотехнологии. Метод культуры клеток используется и развивается в самых различных направлениях. С его помощью был, прежде всего, получен очень важный результат; было доказано, что, подобно бактериям и простейшим, клетки многоклеточных организмов могут развиваться в культуре в течение неопределенно долгого времени. Каррелевская культура клеток сердца эмбриона курицы поддерживалась путем пересевов в питательной среде, содержащей эмбриональный экстракт и плазму крови, с 1912 по 1946 г, за что ученый был удостоен Нобелевской премии.
Дальнейшие успехи в разработке метода культур клеток были обуслов-лены, главным образом, созданием и усовершенствованием питательных сред, содержащих необходимые для жизни клеток вещества. Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей растительных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массовые исследования по разработке новых питательных сред, включающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березовый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.
В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового класса фитогормонов - цитокининов - оказалось, что при совместном их действии с другим классом фитогормонов - ауксинами - появилась возможность стиму-лировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролируемых условиях.
Основы использования клеток человека и животных в биотехнологии были заложены в 1949 г, когда группе американских ученых удалось вырастить вирус полиомиелита в культивируемых клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Теперь уже не представляет проблемы производство в ферментерах клеточных культур, содержащих вирус. Существуют клетки, которые используют для выращивания: вирусов во всем мире. Это клетки HeLa (карцинома шайки матки человека), BHK-2I (почка эмбрионов хомяка) и Vero (почка зеленой мартышки). Благодаря применению метода клеточных культур вирусы стали выделять в чистом виде, что позволило усовершенствовать методы диагностики вирусных заболеваний и самое главное - получить вакцины, такие, например, как против ящура, оспы, кори, полиомиелита.
Культуры клеток, тканей или органов широко использовались и используются сейчас в научных исследованиях. Они являются методом сохранения жизнеспособности или выращивания вне организма отдельных клеток, а также организованных структур (ткани, органы, эмбрионы) сохраняющих свою дифференцировку. С того времени, как ученые нашли способ выделения чистых клеточных линий, метод культуры клеток стал идеальным способом изучения строения и свойств живых клеток. Культуры клеток, получаемые современными методами, представляют собой гомогенные популяции генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.
Культивируемые клетки дают возможность изучать прижизненное (витальное) состояние клеток методом микроскопии. На животном или растении можно определить состояние клеток организма только в конце эксперимента, удалив клетки из организма животного. С помощью культур клеток изучают межтканевые и межклеточные взаимодействия, дифференцировку, рост, деление клеток, их вирусную трансформацию, особенности обмена веществ в живых клетках, потребности их в питании, методы клонирования и хранения, чувствительность к различным веществам, в том числе лекарствам, ядам. Культуры клеток обеспечивают реальные значения скорости включения и метаболизма исследуемых соединений в клетках, поскольку отсутствует метаболизм этих веществ печенью, запасание их в мышцах, экскретирование почками. На клетках культур делают различные операции: удаляют части клетки, вводят в нее вирусы, проводят генетические эксперименты. Органные культуры используются при изучении закономерностей развития зачатков органов в норме и в эксперименте, при совместном культивировании органов от разных особей одного или нескольких видов, а также для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов и тканей, предназначенных для пересадки (трансплантации).
Культуры клеток животных и человека могут служить и уже служат идеальным источником различных биологически активных веществ: ферментов, антигенов, онкогенных и моноклональных антител, гормонов, инсулина, интерферона. Многие из этих препаратов, например, половые гормоны, инсулин, интерферон, антитела, получаемые от животных, или генноинженерными методами из микроорганизмов не обладают достаточной специфичностью или алергенны, поэтому малоэффективны для человека.
Однако попытки получения полезных веществ с помощью культур клеток часто заканчиваются неудачей. Многие клетки животных и особенно человеческие плохо размножаются в культуральной среде, а если и растут, то в большинстве случаев теряют способность к синтезу специфического продукта. Поэтому основным направлением исследований в настоящее время является разработка методов культивирования, позволяющих клеткам сохранять и усиливать ценные специфические функции, в течение длительного времени выращивания. Одними из самых эффективных методов получения стабильных, долго живущих и относительно неприхотливых к условиям культивироввания клеточных культур является их трансформация (обработка некоторыми химическими реактивами или инфицирование их онковирусами) или получение гибридных клеток (гибридом) путем слияния их с некоторыми опухолевыми клетками.
В отличие от вышесказанного, промышленная реализация возможностей культивирования клеток и тканей растений достигла в настоящее время гораздо больших результатов. Во многих странах запущены промышленные производства лекарственных веществ, красителей, витаминов, основанные на различных способах культивирования растительных клеток. Начало было положено японскими фирмами, запустивших в начале 80-х годов ХХ века промышленное производство красителя шиконина и убихинона-10. В СССР было налажено промышленное производство биомассы клеток женьшеня.
Использование культур клеток и тканей как источника сырья для производства различных первичных и вторичных метаболитов имеет целый ряд преимуществ, по сравнению с традиционно используемыми источниками (дикие и культурные растения и животные, живые люди-доноры и органы, извлекаемые из трупов).
1.Возможность круглогодичного выращивания необходимого количества биомассы клеток и тканей.
2.Независимость от климатических и географических факторов.
3. Быстрота накопления целевого продукта (многие растения и животные растут и развиваются в течение десятков лет (женьшень)).
4. Стандартность и более высокое качество сырья.
5. Освобождение земельных площадей, техники и людей, занятых в сельском хозяйстве.
6. Возможность автоматизации и механизации технологических процессов, снижение доли ручного труда.
7. Освобождение страны от импорта сырья.
8. Сохранение редких и исчезающих видов животных и растений, улучшение экологической обстановки.
Существует 3 основных направления создания новых технологий на основе культивируемых клеток и тканей растений. Первое из них – использование результатов исследования биологии растительной клетки и методов клеточной и генной инженерии для генетического изменения клетки и получения на ее основе нового растения. Второе – получение ценных биологически активных веществ растительного происхождения в промышленных масштабах путем культивирования клеток и тканей растений. Третье –использование культур клеток и тканей для быстрого микроклонального размножения и оздоровления растений.
Рекомендуемые страницы:
Воспользуйтесь поиском по сайту:
megalektsii.ru
КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ
В самом общем смысле культура клеток и тканей (далее — культура тканей) - это искусственное in vitro индуцирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.
Основоположниками культуры растительных тканей как новой области биологической науки считаются Ф. Уайт и Р. Готре (начало XX в.). В конце 30-х гг. XX в. был разработан метод выращивания растительных клеток в суспензионной культуре и получения биомассы от единичных клеток, что позволило выделять однородный в генетическом и физиологическом отношении материал.
В странах бывшего СССР освоение метода культуры тканей начато с конца 50-х гг. XX в. и связано с именем Р.Г. Бутенко. В 1967 г. по инициативе И.В. Грушвицкого в Ленхимфарминституте (ныне Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия) была создана первая в стране лаборатория культуры тканей лекарственных растений. Позже подобные лаборатории были созданы во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) (Москва) и Томском медицинском институте (ныне Сибирский государственный медицинский университет).
Первоначально разрабатываемый в чисто теоретическом плане метод культуры тканей, начиная с середины 60-х годов XX в., входит в арсенал особого направления научно-производственной деятельности, известного под названием биотехнология. Технологии, основанные на методе культуры тканей, уже помогают создавать новые формы и сорта сельскохозяйственных растений и получать промышленным путём продукты растительного происхождения.
Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда; антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов. Сосуды, в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени.
В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание исходного генетического разнообразия форм растений, а также клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений.
В природе каллусообразование — естественная реакция на повреждение растений. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т.е. фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу — каллус.
В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая на свежую питательную среду.
Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т.д. Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.
В разработке нетрадиционных клеточных технологий важное место занимают питательные среды. Они должны обеспечить потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для биосинтеза целевого продукта. В состав сред входят смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов), фитогормоны (регуляторы процессов клеточного деления и дифференциации), источники углерода в виде сахарозы. Имеют значение температура, освещение, содержание газов и другие условия.
Одна из важных особенностей культуры тканей — сохранение в ряде случаев способности к синтезу продуктов вторичного метаболизма, свойственных интактным растениям данного вида, — алкалоидов, гликозидов, компонентов эфирных масел, стероидов и др.
В культивируемых каллусных клетках, особенно при длительном выращивании in vitro, возникают, сохраняются в клеточных поколениях, а часто и селектируются, т.е. отбираются и начинают преобладать, многочисленные геномные вариации. Эта изменчивость представляет собой основу для отбора клеточных линий и штаммов с высокой биосинтетической способностью (суперпродуцентов). Хотя использование сырья, получаемого при культуре тканей и клеток in vitro, выгодно пока только для тех продуктов, рыночная стоимость которых достаточно высока на международном рынке, тем не менее, биотехнологические программы уже созданы в СНГ и многих странах мира.
Переход от научных разработок к промышленному получению продуктов с использованием клеточных культур только начинается. Однако этим методом уже получают некоторые высокоценные вещества и продукты. В Японии из культивируемых тканей воробейника краснокорневого получают шиконин с широким спектром антисептического действия и убихинон-10 из клеток табака, в Германии — кислоту розмариновую из колеуса. В нашей стране биохимические заводы выпускают клеточную биомассу женьшеня, а также получены высокоаймалиновые штаммы раувольфии змеиной.
Каллусные клетки в культуре тканей in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений-регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов. Такие растения получили название сомаклональных вариантов. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью.
Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез (обработка мутагенными веществами), а также селективные условия культивирования клеток. Спонтанно возникшие или индуцированные мутанты в популяции отбираются на устойчивость к созданным жёстким условиям: высоким концентрациям солей, экстремальным температурам, гербицидам, токсинам и др. В результате проведения многих экспериментов удаётся отобрать действительно устойчивые линии и получить растения-регенеранты из стабильной клеточной линии.
В СНГ методом клеточной селекции получены клоны: сорта картофеля, устойчивые к высоким концентрациям хлорида натрия, низким температурам, раку картофеля, а также патогену и токсину, вызывающим кольцевую гниль клубней; рис, устойчивый к низким температурам и засолению, и др.
Клеточная селекция — одна из наиболее полезных клеточных технологий для создания сортов не только важнейших сельскохозяйственных, но и лекарственных растений. Работы А.Г. Воллосовича в 70-80-х гг. XX в. с культурой тканей раувольфии змеиной привели к созданию высокопродуктивных аймалинсодержащих штаммов.
В настоящее время интенсивно развиваются работы по созданию высокопродуктивных штаммов и растений-регенерантов методами гибридизации соматических (неполовых) клеток путём слияния протопластов и генной инженерии. Методы соматической гибридизации и генной инженерии пока не получили промышленного развития. Однако учёные считают, что за ними будущее, и генная инженерия станет естественным приёмом при создании нужных человеку форм полезных растений.
Велико значение культуры тканей высших растений для быстрого клонального микроразмножения растений. Клональным микроразмножением называют неполовое размножение растений in vitro, строго идентичных исходному. Этот процесс «миниатюрен» в сравнении с традиционной техникой вегетативного размножения черенками, отводками, усами, прививками, но идёт очень быстро и с высоким выходом посадочного материала. Например, от одной генициали можно получить 105-106 растений в год.
В зависимости от условий клетки в культуре in vitro могут делиться анархически, образуя неорганизованную массу, либо менять программу своего поведения и делиться организованно с образованием зачатков корней, стеблей, зародышей, из которых затем можно регенерировать растения.
Легче всего вызвать морфогенез (образование органов и тканей) и регенерацию растения в целом, используя зародыши, почки, а также стеблевые меристемы. Но для получения растений, даже из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития, или апикальных меристем стебля очень маленьких размеров нужны дополнительные условия, например, очень богатые питательные среды. Обычно в каждом случае разрабатываются особые условия культивирования и соответствующие питательные среды.
Стеблевая меристема (особенно самая её верхушка), как правило, свободна от вирусной инфекции, микоплазм и возбудителей других инфекций. Поэтому клонирование клеток меристематических верхушек, а затем быстрое клональное размножение здоровых растений - основа технологии получения безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лекарственных растений.
Велико значение технологии клонального микроразмножения в селекции растений. Можно быстро размножить уникальный генотип или новый сорт, что ускоряет его практическое использование. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений. Многие из них размножаются уже в производственных условиях. Что касается лекарственных растений, технологии клонального микроразмножения разработаны в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН для мандрагоры туркменской, кирказона маньчжурского, женьшеня, в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии — для ряда видов раувольфии, в ВИЛАРе — для стефании гладкой.
cyberpedia.su
Культура клеток и тканей - «Энциклопедия»
КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, клетки, кусочки тканей или зачатков органов, выращенные вне организма (in vitro). В основе выращивания клеток и тканей лежит строгое соблюдение стерильности и использование специальных питательных сред, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности культивируемых клеток и максимально сходных со средой, с которой клетки взаимодействуют в организме. Метод получения культуры клеток и тканей является одним из важнейших в экспериментальной биологии. Культуры клеток и тканей могут быть заморожены и сохраняться длительное время при температуре жидкого азота (-196°С). Основополагающий эксперимент по культивированию клеток животных провёл американский учёный Р. Гаррисон в 1907 году, поместив кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки в сгусток лимфы. Клетки зачатка оставались живыми несколько недель, из них вырастали нервные волокна. Со временем метод был усовершенствован А. Каррелем (Франция), М. Берроузом (США), А. А. Максимовым (Россия) и другими учёными, использовавшими в качестве питательной среды плазму крови и вытяжку из тканей зародыша. В дальнейшем успехи в получении культуры клеток и тканей были связаны с разработкой сред определённого химического состава для культивирования различных типов клеток. Обычно они содержат соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, факторы роста, антибиотики, предупреждающие заражение культуры бактериями и микроскопическими грибами. Начало созданию метода культуры клеток и тканей у растений (на кусочке флоэмы моркови) положено Ф. Стюардом (США) в 1958.
Реклама
Для культивирования клеток животных и человека могут быть использованы клетки разного происхождения: эпителиальные (печень, лёгкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почка), соединительнотканные (фибробласты), скелетные (кость и хрящи), мышечные (скелетные, сердечная и гладкие мышцы), нервной системы (глиальные клетки и нейроны), железистые клетки, секретирующие гормоны (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и различные типы опухолевых клеток. Выделяют 2 направления их культивирования: культура клеток и органная культура (культура органов и тканей). Для получения культуры клеток – генетически однородной быстро пролиферирующей популяции – кусочки ткани (обычно около 1 мм3) извлекают из организма, обрабатывают соответствующими ферментами (для разрушения межклеточных контактов) и образующуюся суспензию помещают в питательную среду. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом (из-за низкого уровня дифференцировки и наличия стволовых клеток-предшественников в эмбрионах) по сравнению с соответствующими тканями, взятыми из взрослого организма. Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни (так называемый предел Хейфлика), тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. Однако даже в культуре нормальных клеток некоторые клетки спонтанно иммортализуются, то есть становятся бессмертными. Они выживают и дают начало клеточным линиям с неограниченным сроком жизни. Исходно клеточная линия может быть получена из популяции клеток или из отдельной клетки. В последнем случае линию называют клоновой, или клоном. При длительном культивировании под воздействием различных факторов свойства нормальных клеток изменяются, происходит трансформация, основными признаками которой являются нарушения морфологии клеток, изменение числа хромосом (анеуплоидия). При высокой степени трансформации введение таких клеток животному может вызывать образование опухоли. В органной культуре сохраняются структурная организация ткани, межклеточные взаимодействия, поддерживается гистологическая и биохимическая дифференцировка. Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, железистые клетки продолжают секретировать специфические гормоны и т.д. Такие культуры выращивают в культуральном сосуде на плотиках (бумажных, миллипоровых) или на металлической сетке, плавающих на поверхности питательной среды.
У растений культивирование клеток основано, в общем, на тех же принципах, что и у животных. Различия же в способах культивирования определяются структурными и биологическими особенностями клеток растений. Большинство клеток растительных тканей обладают тотипотентностью: из одной такой клетки при определённых условиях может развиться полноценное растение. Для получения культуры растительных клеток используется кусочек любой ткани (например, каллуса) или органа (корня, стебля, листа), в котором присутствуют живые клетки. Его помещают на питательную среду, содержащую минеральные соли, витамины, углеводы и фитогормоны (чаще всего цитокины и ауксины). Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27°С, в темноте или при освещении.
Культуры клеток и тканей находят широкое применение в разных областях биологии и медицины. Культивирование соматических клеток (все клетки органов и тканей за исключением половых) вне организма определило возможность развития новых способов изучения генетики высших организмов с использованием, наряду с методами классической генетики, методов молекулярной биологии. Наибольшее развитие получила молекулярная генетика соматических клеток млекопитающих, что связано с появившейся возможностью постановки прямых экспериментов с клетками человека. Культуру клеток и тканей используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов экспрессии генов, раннего эмбрионального развития, дифференцировки и пролиферации, взаимодействия ядра и цитоплазмы, клеток со средой, адаптации к различным химическим и физическим воздействиям, старения, злокачественной трансформации и др., её применяют для диагностики и лечения наследственных заболеваний. В качестве тест-объектов клеточные культуры являются альтернативой использованию животных при испытании новых фармакологических средств. Они необходимы при получении трансгенных растений, клонального размножения. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при создании гибридов, производстве вакцин и биологически активных веществ.
Смотри также Клеточная инженерия.
Лит.: Методы культивирования клеток. Л., 1988; Культура животных клеток. Методы / Под редакцией Р. Фрешни. М., 1989; Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991; Freshney R. I. Culture of animal cells: а manual of basic technique. 5th ed. Hoboken, 2005.
О. П. Кисурина-Евгеньева.
knowledge.su
Культура клеток и тканей растений in vitro.
Культивирование клеток и тканей растений производят на специальных пит.средах, которые содержат все необходимые для их роста макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны. Среду надо стерилизовать (автоклавировать), чтобы на ней не развивались микроорганизмы. Культуру клеток получают из так называемого первичного эксплантата: изолированного зародыша семени, верхушки или средней части стебля, сегмента листа и т.д. Поверхность первичных эксплантатов стерилизуют в стерилизующих растворах(70% этиловый спирт),затем их промывают дистил.водой, после чего они готовы для введения в культуру. Манипуляции с изолированными тканями – введение эксплантатов в культуру, пересадку культур на свежую пит.среду – производят в условиях асептики(под ламинарным боксом),используя стерильные инструменты и приборы. Культивирование клеток осуществляют в пробирках или колбах, укупоренных ватными пробками или специальными крышками, обеспечивающими защиту внутреннего объема этих сосудов от проникновения посторенней микрофлоры.
В целом культура клеток растений аналогична культуре бактерий. Применяют 2 основных способа культивирования: на твердых (агаризированных) и жидких пит.средах. Обязательное условие – это присутствие в среде двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины инициируют процесс дедифференцированных клеток, а цитокинины вызывают деление дедифференцированных клеток.
Дедифференцировка растительных клеток является важным элементом получения активно делящихся культур. Дело в том, что глубоко специализированные клетки растений утрачивают способность к делению. Для того, чтобы они вновь ее приобрели, необходимо как бы вновь вернуть их в меристематическое состояние, т.е. дедифференцировать.
Следует также упомянуть об культивировании на жидкой пит.среде культуру протопластов. Их получают из паренхимы листа, из каллюстных и суспензионных культур. С помощью спец.ферментов, выделенных из м.о.целюлозные оболочки можно растоврить. Чтобы не повредить содержимое клетки в ходе и после удаления оболочки в пит.среду добавляют осмотики(сахара в больших концертациях). Протопласт сужается и превращается в шар отделенный от оболочки.
Разработка методов получения клонов из единичных клеток при их культивировании in vitro имеет исключительно важное значение для генетической инженерии растений, поскольку делает возможным создание трансгенных растений из единичных трансформированных клеток.
students-library.com
История развития метода культуры клеток, тканей и органов растений
Идея о возможности культивирования клеток вне организма - in vitro - была высказана по клеток растений. Однако впервые в культуру был введен клетки животных. Исследователям долго не удавалось культивировать
растительные клетки на искусственных питательных средах. Успехов в этой области достигли в 30-х годах ХХ века, а бурного развития новое направление исследований приобрел в 60 - 70-х годах того же века. В истории развития этого метода можно выделить несколько периодов.
Период с 1892 по 1902 - первые работы в области развития метода культуры изолированных тканей растений. Этот период связан с именами трех выдающихся немецких ученых: Х. Фьохтинга, К. Рехингера и Г. Габерландт. Не получив экспериментальных успехов, эти исследователи выдвинули ряд идей и гипотез, которые были реализованы значительно позже.
Х. Фьохтинг, изучая явление полярности у растений, пробовал выращивать in vitro небольшие кусочки растительных тканей. Он показал, что полярность присуща даже самым маленьким фрагментам ткани и предположил, что она является свойством самой растительной клетки.
К. Рехингер помещал сегменты стебля тополя, кусочки корня свеклы и одуванчика на влажную поверхность фильтра и наблюдал процесс калюсоутворення. Уменьшая размер эксплантаты, он определил минимальный размер фрагмента, способного образовывать Калюс.
Г. Габерландт впервые высказал идею о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и предложил гипотезу о тотипотентность любой живой растительной клетки. Однако его собственные попытки культивировать на искусственной питательной среде группы клеток палисадная паренхимы листа, эпидермы традесканции были неудачными. Расчет Г. Габерландт на то, что хлорофиллоносных клетки паренхимы обеспечат себя органическими веществами за счет фотосинтеза был ошибочным. Полностью дифференцированные ткани, клетки которых потеряли эмбриональную активность, не росли и не давали новообразований in vitro, а способа их дедиференциации Г. Габерландт не нашел, фитогормоны в то время еще были неизвестны.
Период с 1902 по 1922 годы характеризуется многочисленными попытками подобрать оптимальное питательную среду и условия благоприятны для культивирования in vitro изолированных органов, тканей и клеток растений.
В этот период были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток. Однако попытки вырастить изолированные ткани растений на средах с добавлением экстрактов растительных тканей были неудачными. Ошибкой всех этих исследований было то, что все ученые использовали высоко специализированные растительные ткани. Именно удачный выбор объекта определил успехи В. Робинса и Котте, которые в 1922 году одновременно и независимо друг от друга показали возможность культивирования на искусственной питательной среде меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты можно считать началом применения метода культуры изолированных органов растений.
Период с 1932 по 1939 годы начинается с работ американского исследователя Ф.Уайта и французского Р.Готре. Успех этих исследователей обусловили удачный выбор объектов исследования и тщательный подбор состава питательной среды для культивирования. Они повторили опыт В.Роббинса и Котте и показали, что изолированные корни могут расти в культуре неограниченно долго, если их кончики периодически пересаживать на свежий питательную среду. Способность к неограниченному росту при субкультивуванни была продемонстрирована позже этими же авторами для каллусных ткани камбиального и паренхимных происхождения, а также для тканей растительных опухолей. Это открытие дало новый толчок в работе по культуре растительных тканей.
В период с 1940 по 1960 гг увеличилось количество видов растений, ткани которых выращивали in vitro. Их список составил 142 вида. Длительно пересаджувани культуры успешно получали из различных органов и тканей растения. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение макро-и микроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности ткани. Обнаружена потребность культур в витаминах и стимуляторах роста. Оценено значение натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий. Именно в работе с культурой тканей в 1955 году открыт новый класс фитогормонов - цитокинины и показано их значение для деления клеток in vitro и индукции стеблевой морфогенеза.
В этот период разработан метод получения и выращивания больших масс клеточных суспензий и метод культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки, деление которой индуцируется с помощью ткани-няньки.
Период с 1960 по 1975 гг Важнейшим событием этого периода была разработка Е.К. Кокингом метода получения изолированных протопластов из ткани корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитичних и целюлитичних ферментов. Позже И.Такебе с сотрудниками подобрали условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенеза. Впервые получены и изучены растения-регенерантов табака, которые были сомаклональной вариантами исходной формы.
Одновременно изолированные протопласты еще не образовали клеточную стенку, были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) и введение в них вирусной РНК, клеточных органелл, клеток бактерий.
Первые соматические гибриды были использованы как модели для изучения поведения ядерного и цитоплазматического геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и в потомстве соматических гибридов растений.
В этот же период французским ученым Ж.Морелем разработан метод культуры меристем, который позволяет получать безвирусные растения. С помощью этого метода оздоровлены растения размножаются с высоким коэффициентом.
Период с 1976 года и сегодня - разработан метод електрозлиття изолированных протопластов (U.Zimmerman, 1983) и методы селекции гибридных клеток. С использованием изолированных протопластов и векторов, основанных на Ти-и Ri-плазмид Agrobacterium tumefaciens и A.rhizogenes разработан эффективный способ переноса генов для двудольных растений. Разработан метод баллистической трансформации или микробомбардування, который эффективно применяется и для однодольных растений.
Методы мутагенеза и клеточной селекции, получения сомаклональной вариантов применяют для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных растений.
Методы скрининга биохимических мутантов привели к появлению более производительных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых в промышленности.
В Украину экспериментальные работы по культивированию тканей растений начатые 1949 рок в Институте физиологии растений АН УССР. Здесь в управляемым профессором Ф.Л.Калининим отделе роста и развития проведены работы по изучению физико-химических и биохимических механизмов опухолевой трансформации растительных клеток, микроклонального размножения и др..
Активное развитие различных направлений биотехнологии растений приходится на 70-80 годы. В этот период в Институте ботаники имени М.Г. Холодного под руководством академика К.М.Ситника проводятся оригинальные работы по гибридизации протопластов и клеточной селекции.
Сегодня теоретические и практические аспекты биотехнологии решаются в ряде научных и высших учебных заведений. Среди них - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Институт картофелеводства УААН, Институт садоводства УААН, Институт сахарной свеклы УААН, Государственный Никитский ботанический сад и другие. Украинскими учеными охвачено широкий круг исследований, которые имеют большое значение для развития отечественной и мировой биотехнологии.
worldofscience.ru
Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
В свете современных представлений биотехнология растений - это соединение методов культуры клеток и тканей растений с методами молекулярной биологии и техникой рекомбинантных ДНК. Созданная система -клетки и ткани высших растений, выращиваемые вне организма на искусственных питательных средах в строго контролируемых условиях - позволяет изучать рост, клеточную дифференцировку и развитие растительного организма, разрабатывать новые клеточные технологии для промышленности и сельского хозяйства.
Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно называется биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная инженерия.
Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей, состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология.
Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуждаемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изолированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него.
Тотипотентность растительной клетки
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности.Тотипотентность (лат. Totus - весь, potentia - сила) - это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма.
Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму.
У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется.
Однако клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих, в условиях культивирования могут сохранять плюрипотентность - способность дифференцироваться во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых клеток.
У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - вегетативное размножение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое.
Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus - толстая кожа, мозоль).
Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов.
Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению.
Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов.
Исторические этапы развития методов культивирования in vitro
Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при прививках.Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, индуцированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Трекулу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы).
Тотипотентность теоретически постулирована клеточной теорией, сформулированной в независимых работах Шлейдена (1838), проведенных на растительных объектах, и Шванна (1839) - на растительных и животных объектах.
Классические эксперименты были выполнены немецкими ботаниками Фёхтингом (1878) и Рехингером (1893). Фехтинг выявил наличие полярности у изолированных (даже очень тонких) фрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали в апикальной части почки, а в базальной - каллус или корни. Рехингер определил, что даже минимальные размеры эксплантов способны продуцировать почки и регенерировать целые растения, однако этот размер ограничен.
При культивировании фрагментов из почек тополя и ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал, что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный слой) способность к регенерации перестает проявляться.
Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга.
Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение асептических условий.
Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы.
Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных, палисадные клетки из листьев яснотки).
В условиях культивирования такие клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют стимулы, исходящие от целого организма или его частей.
Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).
Выполненные в те годы работы по культивированию изолированных тканей растений на экстрактах из растительных тканей не были продуктивными. Лишь значительно позже, в 40-50-е гг., при использовании жидкого эндосперма кокосового ореха - кокосового молока, было показано, что растительные экстракты могут оказывать стимулирующее действие на рост изолированных органов и тканей в условиях культивирования, но только при их добавлении к основному составу синтетических сред.
На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.
Практическое применение культуры изолированных зародышей для преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате были выращены гибридные растения.
В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.
Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред.
Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании) отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно долго. Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.
Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов.
Основные объекты культивирования в работах Готре - камбиальная ткань стебля древесных и травянистых растений, ткань корнеплодов и клубней. В основе минерального состава среды была использована питательная смесь Кнопа. Готре заменил жидкую среду на твердую - агаровую и ввел в состав культуральных сред фитогормон ауксин - индолилуксусную кислоту (ИУК). Наличие этих компонентов в среде способствует длительной пролиферации культивируемых каллусных тканей. В работах Готре каллусная ткань, индуцированная из камбия, могла продолжать развитие в течение 18 месяцев.
После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений.
Ауксины были открыты в 20-е гг. как факторы тропизмов растений. Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде р-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) - ИУК. Этот фитогормон был открыт в 1926 г. Вентом. В начале 30-х гг. Ф. Кегль выделил его в чистом виде и установил химическое строение. В 60-е гг. был выделен второй представитель этого класса фитогормонов - фенилуксусная кислота (ФУК).
Другой класс фитогормонов - цитокинины - открыли в 1955 г. Скуг и Миллер, изучая рост каллуса сердцевинной паренхимы табака. Путем щелочного гидролиза ДНК животного происхождения они получили кинетин, который оказался способным вместе с ауксином стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы и камбия табака. На среде с ИУК без кинетина клетки не делились. В дальнейшем различные концентрации и соотношения цитокининов и ауксинов стали использоваться для каллусогенеза и индукции морфогенеза в культуре изолированных тканей растений.
В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений.
В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1 960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки.
В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).
В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.
В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений.
В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны сомаклональные варианты табака. Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.).
Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
medbe.ru
