Биореактор для культивирования клеток растений своими руками. Биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии

Детский сад № 4 "Золотая рыбка"

город Карпинск Свердловской области

 
ГлавнаяРастенийБиореактор для культивирования клеток растений своими руками

Биореактор для культивирования клеток на микроносителях. Биореактор для культивирования клеток растений своими руками


Биореакторы для культур клеток - BIORUS

01.12.2015

Биореакторы для культур клеток

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reactors) также решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной ( batch), стационарной с подпиткой ( fed- batch) или непрерывной ( continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост - лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста. Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Компания Bioengineering предлагает большой ассортимент реакторов для обеспечения наилучших условий культивирования различных типов клеток.

Клеточный ферментер - биореактор 

Клеточный ферментер (биореактор) представляет собой резервуар с мешалкой, сконструированный для культивирования клеток животных. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Для минимизации стресса при ранении перемешивание осуществляется лопастной мешалкой морского типа.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Реактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании можно использовать роторные или спиральные фильтры (см. ниже).

Встроенное устройство пробоотбора обеспечивает стерильный отбор контагиозных клеток (например, для производства вирусов).

 

Для того, чтобы не травмировать клетки в процессе продувки можно установить различные системы аэрации, например, пульверизаторы (барбатеры), систему поверхностной аэрации или использовать безпузырьковую продувку через силиконовые трубочки.

Эрлифтный ферментер

В этих ферментерах перемешивание осуществляется потоком воздуха, а не лопастью мешалки, обеспечивая эффективный массоперенос и низкие силы рассечения. Для контроля за циркуляцией жидкости можно установить вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Распределение газа может осуществляться с помощью перфорированных, пористых или гидрофобных трубок. Если клетки могут повредиться пузырьками газа, можно установить систему безпузырьковой аэрации через силиконовые трубочки.

Биореакторы доступны как лабораторные, так и промышленные. Последние имеют широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов.

Компания Bioengineering предлагает также visual safety airlift fermenter с рабочим объемом в 20 л, с легко снимаемой стерилизуемой фольгой вместо стеклянной или стальной оболочки. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные ферментеры подходят для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.

 

 

Биореактор с взвешенной твердой фазой ( Fluidized bed reactor )

Биореакторы, которые поддерживают носители с иммобилизованными клетками в состоянии суспензии, называются реакторами с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reators).

Обычно в этих реакторах присутствует три фазы – твердая, жидкая и газообразная. Для непрерывного культивирования с задержанием биомассы используется специально разработанная система сепарации. Она состоит из различных камер и обеспечивает полное задержание частиц при перфузионных процессах.

Перемешивание достигается с помощью продувки. Это обеспечивает низкий раневой стресс и равномерный массоперенос. Для чувствительных клеток имеется система безпузырьковой аэрации через силиконовые мембраны (Forschungszentrum J?lich (a), Informationsblatt).

Общий объем реактора составляет 7 л, он поставляется как со стеклянным, так и со стальным цилиндром. В этих реакторах была достигнута высокая плотность клеток CHO, BHK и гибридомы (Forschungszentrum J?lich (b), Informationsblatt).

Биореакторы с взвешенной твердой фазой рекомендуются для клеток на микроносителях (т.е. нуждающихся в опорной поверхности), для клеток, чувствительных к раневому стрессу, для заключенных в капсулу клеток и для продуцирования продуктов секреции в долговременной культуре клеток.

Для защиты чувствительных клеток в ферментерах с взвешенной твердой фазой можно использовать систему безпузырьковой продувки через силиконовые трубочки (со стенками, армированными стекловолокном), которая предотвращает возникновение градиента кислорода в потоке.

Автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой (Autoclavable fluidized bed reactor)

Для лабораторных целей удобен автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой ( AWS). Он оборудован магнитным циркуляционным насосом непрерывного действия. Температура контролируется посредством циркуляционного термостата. Ферментер AWS закреплен на раме и может автоклавироваться со всеми аксессуарами.

 

Биореактор с фиксированной твердой фазой (Fixed bed reactor)

Как альтернативу для культивирования клеток, нуждающихся в фиксации для роста, можно использовать биореактор с фиксированной твердой фазой, в котором клетки и их носители захватываются в закрепленную подложку. Эта система не нуждается в сепарационных приемах для удаления жидкой фазы. Раневой стресс и повреждение клеток пузырьками газа минимальны.

В процессе культивирования через фиксированную подложку циркулирует насыщенная кислородом среда. Поэтому при аксиальном потоке длина подложки является критическим параметром, поскольку обеспечение культуры кислородом и питательными веществами может быть недостаточным. В больших реакторах эту проблему можно решить с помощью радиально распространяющегося потока. Среда, обогащенная продуктами метаболизма, удаляется непрерывно или периодически.

Компания Bioengineering предлагает вставные корзины с подложками для маленьких лабораторных ферментеров ( KLF) и лабораторных ферментеров ( NLF, 19 л). Среда через подложки распространяется радиально. Возможно увеличение объема подложки до 40-75 л (500-1000 л реакторы). В таких реакторах выращивают нуждающиеся в имобилизации и чувствительные к ранению клетки. Система подходит и для долговременного выращивания культур клеток с продуктами метаболизма.

Мембранный ферментер

 Мембранный ферментер состоит из внутренней и внешней камер, которые разделены диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую продувку и задержание биомассы при непрерывном культивировании. С помощью мембранной технологии токсические (низкомолекулярные) метаболиты удаляются, а (высокомолекулярные) соединения удерживаются во внутренней камере (P?rtner et al. 1992). Перемешивание в каждой из камер осуществляется мешалкой. Среда и воздух поставляются во внешнюю камеру. Внешняя камера имеет общий объем 7.1 л, а внутренняя – 2.4 л. Биореактор был сконструирован для непрерывного культивирования, но может быть также использован в стационарных и стационарных с подпиткой процессах. Взвешенные клетки, а также клетки, нуждающиеся в закреплении на микроносителях, также могут выращиваться в этом биореакторе (Bohmann et al., 1992; Bohmann et al., 1993).

 

Системы фильтрации

Системы фильтрации используются при непрерывном культивировании клеток животных с задержанием биомассы. Компания Bioengineering предлагает два различных типа фильтров.

Роторный фильтр

 Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы. Второй вариант более гибкий, поскольку в процессе культивирования фильтр может быть демонтирован, промыт, простерилизован и подключен заново. Превосходное задержание биомассы (80% и более) без ее повреждения достигается даже при крупномасштабном культивировании, которое характеризуется долговременностью и высокими скоростями потока (S?meghy).

 

Спиральный фильтр

 

Спиральный фильтр основан на принципе мембранной фильтрации. Он был специально разработан для больших объемов прокачиваемой среды при минимальной затрате энергии (Winzeler 1990).Спиральный фильтр соединяется с биореактором с помощью проточной системы и может стерилизоваться как на месте, так и в автоклаве. Он особенно удобен для задержания клеток, а также для свободного от клеток пробоотбора, поскольку силы травмирования очень малы.

Список литературы

A. Bohmann, R. P?rtner, H. M?rkl The membrane dialysis bioreactor – a reactor concept for continuous cultivation of animal cells. In: DECHEMA Biotechnology and Bioengineering, Vol, 41, 1993,  1092-272

A. Bohmann, R. P?rtner, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl  The membrane dialysis bioreactor with integrated radial-flow fixed bed-a new approach for continuous cultivation of animal cells. In: Cytotechnology, 9, 1992, 51-57

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) a  Reaktorintegrierte blasenfreie Begasung von Wirbelschichtreaktoren.  Informationsblatt des Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o.J.

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) b  Integrated bioprocess engineering for antibody production. Informationsblatt des  Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o. J.

R. P?rtner, A. Bohmann, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl  Metabolic parameters and stability of suspended and immobilized hybridoma cells.  In: DECHEMA Biotechnology conferences 5, Frankfurt a. M., 1992, 309-312

Z. S?meghy  Improved cell retention system based on the rotating sieve technique. (A copy of the manuscript is available at Bioengineering AG)

H. B. Winzeler  Spiral stack membrane module. High performance low energy input membrane separation unit. In: Chimia 44, 1990, 288-291

bio-rus.ru

Биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии

 

Предложен биореактор эрлифтного типа для промышленного культивирования в глубинной суспензии клеток растений с внутренним контуром циркуляции культуральной суспензии, при этом высота восходящей и нисходящей зон циркуляции, равных по площади, в целях обеспечения высокой интенсивности перемешивания и массопередачи кислорода, составляет от 0,8 до 1,0 от диаметра аппарата.

Настоящая полезная модель относится к биотехнологии, а точнее, к промышленной биотехнологии клеток высших растений, продуцирующих ценные вещества растительной природы, трудно получаемые из интактных растений, или не синтезируемые в них.

Эта молодая отрасль биотехнологии открывает новые перспективы фармацевтической, парфюмерно-косметической и химической промышленности. Однако для коммерческого производства растительных клеточных продуктов необходимо успешное решение двух основных проблем: биологической - иметь высокопродуктивный штамм клеток и технологической - уметь масштабировать процесс. Клеточная культура, суперпродуктивная в лаборатории (шейкерные колбы), может не расти и/или не продуцировать целевой продукт в биореакторах большего масштаба.

Известны лишь отдельные примеры удачного промышленного масштабирования процесса культивирования клеток растений, приведенные в последних обзорах [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52; Collin H.A. // Plant Growth Regulation. - 2001. - V.34. - P.p.119-134; Bourgand F. et al. // Plant Science. - 2001. - V.161. - P.p.839-851].

Из двух основных типов биореактров - культиваторов для клеток микроорганизмов (с механическим или пневматическим перемешиванием, соответственно), для крупномасштабного культивирования клеток растений чаще всего используют аппараты первого типа, обычно называемые баковыми реакторами с мешалкой и относимые к стандартным биореакторам.

Аппараты с пневматическим перемешиванием в зависимости от способа ввода газа в полость аппарата делятся на два подтипа: барботажные и эрлифтные. Последние имеют внутренний или внешний контур циркуляции культуральной суспензии под действием подаваемого газа. По форме пневматически перемешиваемые аппараты обычно выполняются в виде колонн с большим отношением их высоты к диаметру (до 2-3).

Механически перемешиваемые биореакторы по сравнению с пневматически перемешиваемыми, как отмечено [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684], обеспечивают лучшее перемешивание культуры и массопередачу кислорода. Освоенные в серийном производстве, они доступнее и дешевле [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310].

Однако при этом они более энергоемки [ShugelK. // Bioreactor Design, Operation and Control. P.p.99-118]. Из-за наличия движущихся частей в аппарате высок риск контаминации и, главное, гибели клеток от сдвигового стресса [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684]. Поэтому механически перемешиваемые реакторы трудно масштабируются. В обзорах [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52] отмечается, что в большинстве случаев масштабирование сопровождается снижением продуктивности, что связано с проблемами перемешивания и массопередачи. В частности, отмечено [Vogelman H. // 6-th Int. Ferment Symp. - London. - 1980. - P.p.839-851], что из-за больших напряжений сдвига, которые достигают 7000 дин·см2, в аппарате вместимостью 20 м3 биомасса клеток табака, считающихся достаточно толерантными к сдвиговому стрессу, в 2-3 раза ниже, чем во встряхиваемых колбах.

Клетки растений весьма чувствительны к воздействию механических сил (удары лопастями мешалок, об стенки аппаратов) и срезывающих усилий, или напряжений турбулентных потоков слоев жидкостей. Эта чувствительность связана с большими размерами растительных клеток, относительной хрупкостью их целлюлозно-пектиновых оболочек, а также вакуолизацией [Липский А.Х. и др. // Культура клеток растений. «Наука», М., 1981. - С.51-68; Hooker B.S. et al. // Biotech. Bioeng. - 1990. - V.35. - P.p.296-304]. Подвергаясь воздействию определенного уровня стресса, клетки могут разрушаться или деформироваться, что вызывает их гибель или, по меньшей, но нежелательной мере, нарушение биосинтеза целевых продуктов. Исследователи пришли к заключению, что для успешного культивирования клеток растений в биореакторе необходимо иметь определенный компромисс таких эффектов, как перемешивание, массопередача кислорода, напряжение или скорость сдвига [Moo-Yong М., Chisti Y. // 8-th Int. Biotechn. Symp. - Paris. - V.1. - P.p.454-466].

Пневматически перемешиваемые биореакторы, особенно эрлифты, характеризуются более низким сдвигом по сравнению с механически перемешиваемыми и легко масштабируются, но хуже перемешиваются (особенно барботажные), из-за чего имеются мертвые зоны, происходит оседание клеток и более низка интенсивность массопередачи кислорода (особенно в эрлифте) [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684].

Из проанализированного материала следует, что по большинству показателей (особенно по такому важному, как сдвиговый стресс) эрлифт предпочтительнее как механически перемешиваемых, так и барботажных биореакторов. Но в эрлифте менее интенсивна массопередача кислорода, что может не соответствовать потребностям культур с высокой дыхательной активностью при максимизации выхода биомассы и целевых продуктов.

Поэтому технической задачей настоящей полезной модели является создание конструкции эрлифта для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствие застойных зон и травмирования клеток.

Простейшей конструкцией эрлифта с внутренним контуром циркуляции может служить вертикальная цилиндрическая металлическая емкость с крышкой. Внутри емкость разделяется на две зоны примерно одинаковой площади с помощью трубы или вертикальной перегородки, расположенных обычно по центру емкости на некотором расстоянии от дна и крышки аппарата. Под одну из зон подают воздух (или, если необходимо, смесь газов), и в этой зоне газожидкостная смесь с биомассой поднимается вверх, а по другой зоне она, содержащая меньше газа, опускается вниз. Так происходит перемешивание культуральной суспензии, которое характеризуется параметром - временем полного перемешивания.

По существующим рекомендациям устройства эрлифтов, которые обычно представляют собой колонные аппараты с большим отношением высоты к диаметру, трубы (перегородки) также имеют большую высоту, равную по величине примерно двум - трем диаметрам аппарата [Moo-Yong М., Chisti J. // 8-th Int. Biotechn. Symp.- Paris. - V.1. - P.p.454-466]. Однако, как показали многочисленные исследования авторов для адекватного перемешивания в биореакторах для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии достаточно иметь высоту зон циркуляции в эрлифте примерно равной диаметру биореактора. Для этого в биореакторе для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с пневматическим перемешиванием эрлифтного типа, внутри которого установлен вертикальный элемент, обеспечивающий создание внутреннего контура циркуляции культуральной суспензии с равной площадью зон входящего и нисходящего потоков, высота вертикального элемента составляет от 0,8 до 1,2 диаметра биореактора. При этом вертикальный элемент представляет собой сплошную перегородку по центру аппарата или коаксиально установленную трубу.

На представленных чертежах на фиг.1 показан биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с внутренним вертикальным элементом в виде перегородки, а на фиг.2 - в виде коаксиально установленной трубы.

Биореактор на фиг.1 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н2D, внутреннюю перегородку 2 с отношением высоты к высоте биореактора h0,5 H и воздушный барботер 3 с диаметром <D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.

Биореактор на фиг.2 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н2D, коаксиально установленную трубу 2 с отношением высоты к высоте биореактора h0,5 Н и отношением диаметра к диаметру биореактора и воздушный барботер 3 с диаметром <D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.

Биореактор работает следующим образом. В подготовленный биореактор загружают питательную среду, стерилизуют ее водяным паром требуемого давления в течение необходимого времени, после охлаждения среды до температуры культивирования вводят в нее клеточный инокулят, устанавливают постоянный температурный режим культивирования путем подачи в теплообменное устройство биореактор термостатируемой воды, (на чертеже не показано) Для перемешивания питательной среды с клетками, а также для подачи в нее кислорода и отвода других газов через барботер 3 подают стерильный воздух с постоянным увеличением его расхода по установленному графику по мере роста биомассы клеток, сопровождаемого повышением концентрации клеток и потребности их в кислороде (на общую массу). Насыщенная воздухом из барботера 3 культуральная суспензия поднимается в восходящей зоне (образуемой перегородкой 2) вверх, откуда, освобождаясь от воздуха, по нисходящей зоне опускается в низ биореактра. Таким образом происходит вертикальная циркуляция культуральной суспензии в биореакторе, ее перемешивание и массообмен с воздухом, кислородом и другими газами.

Кроме обеспечения требуемого перемешивания и массопередачи кислорода при высоте разделительных перегородок 2 указанного размера представляется возможным использовать в качестве конструктивной основы эрлифта с внутренним контуром циркуляции стандартные биореакторы бакового типа в их оснащении, у которых отношение общей высоты к диаметру составляет около 1,5-2. В этом случае вместо мешалки внутри биореактора размещается труба 2 с высотой, не превышающей его диаметр, (оптимально, как показано на фиг.2). Внизу одной из зон, образованных трубой 2, должен быть расположен воздушный барботер 3, устроенный согласно любой из приемлемых конструкций. Над верхним краем трубы 2 в ходе культивирования должен поддерживаться минимальный уровень жидкости, обеспечивающий перелив из восходящей в нисходящую зоны.

Авторы проводили опыты по культивирования клеток растений в биореакторах различных конструкций. В них культивировали, в частности, клетки стефании гладкой Stephania glabra (Roxb) Miers, представляющие коммерческий интерес в связи с возможным использованием их вторичнонго метаболита - алкалоида стефарина для производства медицинского препарата антихолинэстеразного действия - стефаглабрина сульфата.

Клетки довольно успешно культивировали ранее в лабораторных биореакторах с перемешиванием механическим [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193] и барботажным [Решетняк О.В. и др. // IX Междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». - Звенигород. - 2008. - С.322]. Емкость аппаратов - 14 и 20 л, соответственно. При этом было установлено, что для получения высоких выходов стефарина, как в шейкерных колбах, необходимо производить культивирование при довольно высоком значении коэффициента массопередачи кислорода, равном 17 ч-1 и создаваемом в биореакторе с механическим перемешиванием. В барботажном биореакторе клетки в большей массе оседали у дна биореактора, что, возможно, разрушало их структуру и ухудшало массопередачу кислорода и питательных веществ между клетками и культуральной жидкостью. Удельный объемный выход биомассы был в 1,3 раза ниже, а содержание в ней стефарина в 1,6 раза меньше, чем в шейкерных колбах.

В связи с вышеизложенным исследовали культивирование клеток стефании гладкой в опытных биореакторах емкостью 100-250 л с перемешиванием механической мешалкой и пневматическим способом, как предлагается в настоящей полезной модели.

Результаты этих опытов изложены ниже.

Пример 1

Проводили культивирование в биореакторе БИОР-0,1 бакового типа емкостью 100 л отечественного производства (изготовитель - ОКБ ТБМ, г.Кириши, Ленинградская область) с механической мешалкой. Аппарат представляет собой вертикальную цилиндрическую емкость с внутренним диаметром 0,4 м, высотой - 0,81 м, снабженную теплообменной рубашкой, турбинной мешалкой с магнитной муфтой с регулируемым числом оборотов, штуцерами для ввода и вывода материальных потоков и установки КИП и А. Ранее такой аппарат был успешно использован для культивирования в заводских условиях (НПО «Восток», Кировская область) клеток женьшеня Panax ginseng С.А.Меу [Шамков Н.В. и др. // Биотехнология. - 1991. - 1. - С.32-34].

В стерильный аппарат БИОР-0,1 заливали 55 л питательной среды рекомендуемого состава [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193], стерилизовали ее паром, устанавливали температуру (26±1)°С, засевали клеточной культурой, выращенной в шейкерных колбах, из расчета 30 г сырой биомассы на 1 л свежей питательной среды в аппарате. Включали минимальное перемешивание (150 об/мин) и подачу стерильного воздуха от 60 л/ч и, возможно, выше при наличии роста клеток (требуемое максимальное значение коэффициента массопередачи кислорода 17 ч-1 достигается в данном аппарате при подаче воздуха 2 м3/ч). Культивирование проводили с периодическим отбором проб на анализ концентрации клеток, их жизнеспособности и содержания стефарина.

За время культивирования в аппарате не обнаружено роста клеток, а доля жизнеспособных снизилась с 85% до 30%.

Аналогичным образом проводили культивирование клеток стефании гладкой в биореакторе БИОР-0,25 бакового типа (высота 1 м, диметр 0,6 м) емкостью 250 л с мешалкой при минимальной скорости 100 об/мин. В аппарат загружено 150 л свежей питательной среды и в общем подготовка культивирования проведена, как описано выше. Получены по существу аналогичные результаты. Сырая биомасса - 18 г/л (засеяно 30 г/л), сухая - 2 г/л, содержание стефарина - 0,14% по сухой биомассе, доля жизнеспособных клеток - 54%.

Таким образом, условия культивирования в испытанных стандартных биореакторах бакового типа при скорости вращения мешалки в диапазоне 100-150 об/мин оказались неприемлемыми для выращивания клеток стефании гладкой.

Пример 2

На базе стандартного биореактора БИОР-0,1 бакового типа вместимостью 100 л сконструирован эрлифтный аппарат с внутренним циркуляционным контуром. Для этого в полости аппарата вместо мешалки коаксиально смонтировали металлическую трубу внутреннего диаметра 0,25 м на высоте 0,31 ми на расстоянии 0,09 м от днища аппарата. Под трубой горизонтально расположили кольцевой воздушный барботер диаметром 0,15 м, имеющий вверху отверстия для выхода воздуха диаметром по 1,5 мм на расстоянии 20 мм друг от друга. В этом модернизированном аппарате максимально требуемое значение коэффициента массопередачи кислорода для культивирования клеток стефании гладкой достигается при подаче воздуха до 4 м3 /ч.

В созданном эрлифтном аппарате, подготовленном технологически и засеянном исходной культурой из шейкерных колб аналогично изложенному выше (пример 1), провели культивирование клеток стефании гладкой вышеописанным способом, но с перемешиванием только сжатым воздухом (без мешалки), подаваемым через кольцевой барботер в коаксиальную трубу. Подача воздуха на аэрацию составляла от 0,06 м3/ч и выше в зависимости от текущей концентрации биомассы. Культивирование осуществляли периодическим способом циклами до 2-х недель каждый до достижения максимальной концентрации клеток.

Таким образом, проведено более 10 циклов культивирования с получением концентрации клеток по сырой биомассе от 200 до 300 г/л, по сухой - от 13 до 18 г/л при доле жизнеспособных клеток 80-90%. Содержание стефарина в сухой биомассе, определенное экстракционно фотоколориметрическим методом [Бидниченко Ю.И. // Дис. канд. фарм. наук. - Львов. - 1990], составляло в среднем 0,2%. Эти показатели статистически не отличаются от тех, которые наблюдались в параллельных опытах культивирования клеток в шейкерных колбах: сырая биомассы - 200-400 г/л, сухая биомасса - 15-21 г/л, жизнеспособность клеток 80-90%, содержание стефарина в среднем 0,2%.

Пример 3

Аналогично вышеописанному провели культивирование клеток стефании гладкой в эрлифтном аппарате вместимостью 250 л, созданном на базе стандартного биореактора бакового типа с мешалкой БИОР-0,25. На месте мешалки установили коаксиальную трубу диаметром 0,4 м высотой 0,5 м от днища аппарата. Под ней разместили воздушный барботер диаметром 0,24 м с отверстиями диаметром 1,5 мм на расстоянии по 20 мм.

В эрлифтном биореакторе на базе БИОР-0,25, содержащем 150 л культуральной суспензии, проведено культивирование клеток стефании гладкой со следующим результатом: сырая биомасса - 200 г/л, сухая биомасса - 13 г/л, доля живых клеток - 80%, содержание стефарина в сухой биомассе - 0,2%. Эти показатели практически не отличаются от полученных в эрлифте емкостью 100 л, а также в шейкерных колбах.

Таким образом, в аппаратах емкостью 100 и 250 л, обустроенных согласно настоящему предложению, практически проведено масштабирование процесса культивирования клеток растений от лабораторного уровня (шейкерные колбы).

Таким образом, авторами создана конструкции эрлифтного биореактора для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствием застойных зон и травмированием клеток.

1. Биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с пневматическим перемешиванием эрлифтного типа, содержащий цилиндрический корпус с установленным в нем вертикальным элементом высотой от 0,8 до 1,0 диаметра биореактора для создания внутреннего контура циркуляции культуральной суспензии с равной площадью зон входящего и нисходящего потоков.

2. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что вертикальный элемент представляет собой перегородку.

3. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что вертикальный элемент представляет собой коаксиально установленную трубу.

poleznayamodel.ru

Биореактор для выращивания клеток

Изобретение относится к медицине и биологии. Биоректор содержит сосуд, состоящий из цилиндрической средней части и герметично связанных с ней верхней крышки и дна, выполненного в виде нижней крышки, и имеющих по меньшей мере одно отверстие для подвода или отвода питательной среды или кислорода. Указанные крышки имеют кольца с резьбой на внутренней поверхности, а цилиндрическая средняя часть сосуда - наружную резьбу для образования герметичного резьбового соединения с кольцами крышек. Изобретение обеспечивает удобство обслуживания биореактора и возможность извлечения выращенных клеток без их повреждения. 9 з.п. ф-лы, 13 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и биологии.

Известен биореактор для выращивания клеток в сосуде, состоящем из цилиндрической средней части и герметично связанных с ней верхней крышки и дна, выполненного в виде нижней крышки, и имеющих по меньшей мере одно отверстие для подвода или отвода питательной среды (патент JP 08-154663 опубликован в 1996 г.).

Недостаток этого реактора заключается в сложности выращивания клеток и в неудобстве в обслуживании.

Биореактор согласно данному изобретению обладает по сравнению с устройством по вышеописанному патенту многими преимуществами. Биореактор согласно данному изобретению обеспечивает высокую герметичность и стерильность и позволяет быстро закладывать в него и извлекать из него клетки. Кроме того, данный биореактор можно очень легко очищать. Благодаря этим преимуществам биореактор согласно данному изобретению можно успешно использовать в серийном производстве.

Техническим результатом изобретения является удобство обслуживания биореактора и возможность извлечения выращенных клеток без их повреждения.

Технический результат достигается тем, что в биореакторе для выращивания клеток, содержащем сосуд, состоящий из цилиндрической средней части и герметично связанных с ней верхней крышки и дна, выполненного в виде нижней крышки, и имеющих по меньшей мере одно отверстие для подвода или отвода питательной среды или кислорода, указанные крышки имеют кольца с резьбой на внутренней поверхности, а цилиндрическая средняя часть сосуда - наружную резьбу для образования герметичного резьбового соединения с кольцами крышек.

Для плотного соединения между крышкой и сосудом могут быть предусмотрены зажимные кольца, уплотнительные кольца или же резьбовые соединения с внутренней и наружной резьбой.

Очень хорошие условия герметизации и тем самым давления обеспечиваются при снабжении крышки или крышек кольцами, которые в этом случае с герметизацией охватывают снаружи цилиндрическую среднюю часть сосуда.

Если биореактор согласно изобретению необходимо подвергать воздействию движения качания или движения вращения, то можно расположить кольца, которые охватывают крышку или крышки и сосуд и к которым можно присоединять устройства вращения или качания.

Для создания давления во внутреннем пространстве сосуда можно применять самые различные устройства для создания давления. Для этого пригодны, например, цилиндропоршневые блоки, которые для создания переменного давления могут также работать в соответствующем импульсном режиме.

Устройство для создания давления питательной среды содержит намагничиваемую шайбу, расположенную с возможностью перемещения в сосуде и создания давления питательной среды на клетки, и средство ее намагничивания.

Шайба выполнена в виде решетки или сетки или с отверстиями для протока культуральной среды.

Устройство для создания давления питательной среды может представляет собой гидравлическое или пневматическое устройство, содержащее фольгу или пластину, или мембрану, расположенную в сосуде.

При необходимости можно выполнять сосуд также в виде двухкамерной системы для выращивания двух разных клеток или же двух одинаковых клеток по отдельности.

В этом случае предпочтительно снабдить крышку сосуда подвесным устройством, на котором расположена платформа для размещения клеток. За счет этого выращивание одного типа клеток происходит на платформе, в то время как выращивание других клеток может происходить на дне сосуда.

Стенка сосуда может быть в случае необходимости выполнена также пористой или газопроницаемой, так что с этой стороны можно также подавать питательную среду и/или газообразную среду, такую как, например, воздух или кислород.

Изобретение поясняется ниже чертежами, на которых схематично изображено:

фиг.1 - продольный разрез биореактора с подводящими отверстиями, расположенными на верхней и нижней крышке;

фиг.2 - продольный разрез биореактора, верхняя крышка которого имеет одно подводящее и одно отводящее отверстие;

фиг.3 - вариант выполнения биореактора с резьбовыми соединениями;

фиг.4 - разрез биореактора с устройством для создания давления питательной среды;

фиг.5 - разрез биореактора с подвесным устройством;

фиг.6 - биореактор с устройством для создания давления питательной среды;

фиг.6а, 6b и 6с - виды сверху на шайбы различной конструкции;

фиг.7 - вариант конструкции биореактора с устройством для создания давления для питательной среды;

фиг.8 - вариант биореактора с гидравлическим или пневматическим устройством;

фиг.9 - вариант биореактора, аналогичный изображенному на фиг.8;

фиг.10 - вариант биореактора, аналогичный показанному на фиг.8.

Биореактор для выращивания клеток содержит сосуд 1, состоящий из цилиндрической средней части и герметично связанных с ней верхней крышки 3 и дна, выполненного в виде нижней крышки 12, и имеющих по меньшей мере одно отверстие 8 для подвода или отвода (9) питательной среды или кислорода, указанные крышки имеют кольца с резьбой (4) на внутренней поверхности, а цилиндрическая средняя часть сосуда - наружную резьбу (2) для образования герметичного резьбового соединения с кольцами крышек (фиг.1).

На фиг.2 показан вариант выполнения биореактора, аналогичный показанному на фиг.1, при этом только в верхней крышке 3 расположено отверстие 8 для подвода и отверстие 9 для отвода. Так же, как в примере выполнения, показанном на фиг.1, на обеих торцевых сторонах цилиндрической средней части сосуда 1 предусмотрены уплотнительные кольца 5.

На фиг.3 показан вариант выполнения биореактора, в котором резьбовое соединение между сосудом 1 и крышками 3 и 12 образовано с помощью внутренней резьбы 4 в кольцах 14, которая взаимодействует с наружной резьбой 2 в сосуде 1.

На фиг.4 показан разрез биореактора, в котором внутри сосуда 1 образована полость 6 для клеточной культуры. Полость 6 для клеточной культуры подвергается воздействию давления с помощью устройства 17 для создания давления в виде цилиндропоршневого блока.

Корпус 18 цилиндропоршневого блока имеет отверстие 8 для подвода питательной среды, которое во входной зоне выполнено с возможностью закрытия обратным клапаном 19, и отверстие 9 для отвода питательной среды.

На фиг.5 показан разрез биореактора с верхней крышкой 3, нижней крышкой 12 и цилиндрической средней частью сосуда 1. Верхняя крышка 3 снабжена подвесным устройством в виде нескольких расположенных с распределением по окружности стержней 21, которые проходят параллельно продольной оси сосуда 1 внутрь сосуда 1. На нижнем конце стержней 21 закреплена платформа 22, на которой размещаются подлежащие выращиванию клетки 7. Подводящее отверстие 8 и отводящее отверстие 9 могут быть расположены в окружной стенке сосуда 1. Однако возможно также их расположение в одной из обеих крышек 3 или 12, как это показано штриховыми линиями. В этом случае также возможны отдельные соединительные отверстия для подачи и отвода.

На фиг.6 показан биореактор с устройством для создания давления питательной среды, на которой показан сосуд, в котором в зоне верхней крышки 3 установлено магнитное устройство 24, например магнитная катушка, через которую пропускается ток. Под магнитным устройством 24 находится намагничиваемая нажимная шайба 25, которая соединена с сосудом 1.

На фиг.6а показан вид сверху шайбы 25, при этом выполнены отверстия 26 для прохождения питательной среды, которая находится внутри сосуда 1.

На фиг.6b и 6с показаны виды сверху шайбы 25 в виде сетки или решетки для прохождения питательной среды.

На фиг.7 показан вариант конструкции биореактора с расширяющимися элементами 28, которые могут перемещать в осевом направлении пластину 29, расположенную с возможностью перемещения в сосуде 1 или в крышке 3.

На фиг.8 показан вариант биореактора с устройством для создания давления на клетки 7 в виде гидравлического или пневматического устройства 30, которое расположено в сосуде 1, соответственно в крышке 3. Устройство 30 имеет подвижную фольгу, пластину или мембрану 31, расположенную в сосуде.

На фиг.9 показан аналогичный вариант выполнения, при этом клетки 7 лежат в геле 32.

На фиг.10 также показан вариант выполнения, аналогичный показанному на фиг.9, при этом уплотнение между верхней крышкой 3 и нижней крышкой 12 осуществляется с помощью уплотнительных колец 33 и 34.

С помощью биореактора согласно изобретению можно выращивать самые различные клеточные культуры.

Внутри сосуда 1 образована полость 6 для клеток, которая подвергается воздействию давления с помощью устройства 17 создания давления в виде цилиндропоршневого блока.

Корпус 18 цилиндропоршневого блока имеет отверстие 8 для подвода питательной среды и подачи ее внутрь сосуда, которое во входной зоне выполнено с возможностью закрытия обратным клапаном 19. С помощью поршня 20 цилиндропоршневого механизма 17 на подаваемую через подводящее отверстие 8 питательную среду оказывается давление, при этом это давление распространяется внутрь сосуда 1. Через отверстие 9 для отвода на противоположной подаче стороне сосуда 1 осуществляется отвод питательной среды. Если во внутреннем пространстве сосуда 1 необходимо создать повышенное давление, которое при необходимости может быть переменным, то в этом случае необходимо дросселировать отвод питательной среды или соответствующим образом закрывать отверстие 9 для отвода.

Для этого вместо подачи питательной среды через подводящее отверстие 8 одна или обе крышки 3 или 12 или окружная стенка сосуда 1 имеют отдельное отверстие. В этом случае можно подвергать внутреннее пространство сосуда 1 и тем самым полость 6 для клеток воздействию давления также с помощью газа, например воздуха.

Для облегчения ввода клетки 7 в сосуд 1 и извлечения из него предусмотрено подвесное устройство со стержнями 21.

На нижнем конце стержней 21 закреплена платформа 22, на которой размещаются подлежащие выращиванию клетки 7. Соединение стержней 21 с платформой 22 может быть при необходимости также разъемным. Возможность разъединения может обеспечиваться, например, с помощью зажимного соединения, за счет чего также обеспечивается более легкое обращение с устройством.

Платформа 22 может быть выполнена в виде сплошного блока. Можно использовать мембрану, например пористую мембрану, которая обеспечивает прохождение кислорода.

Имеется дополнительная возможность для выращивания клеток 7 также на дне 23 сосуда, соответственно на внутренней стороне крышки 12. Таким образом, создается двухкамерная система для выращивания двух клеточных культур.

Вместо отверстия 8 для подвода и отверстия 9 для отвода можно помещать питательную среду в сосуд 1 на продолжительное время, и в этом случае отверстие 8 для подвода и отверстие 9 для отвода служат лишь для подачи кислорода.

В сосуде в зоне верхней крышки 3 установлено магнитное устройство 24, например магнитная катушка, через которую пропускается ток. Под магнитным устройством 24 находится намагничиваемая нажимная шайба 25, которая соединена с сосудом 1.

За счет движения шайбы 25 вследствие активирования магнитного устройства 24, через которое пропускается ток переменного направления, осуществляется внутренняя нагрузка давлением на клетки 7.

В шайбе 25 выполнены отверстия 26 для прохождения питательной среды, которая находится внутри сосуда 1.

Шайба 25 может быть выполнена в виде сетки или решетки для прохождения питательной среды.

Магнитную катушку в качестве магнитного устройства 24 можно также размещать снаружи над крышкой 3. При таком выполнении крышка 3 выполнена из немагнитного материала, например пластмассы. В этом случае можно предусматривать соответственно большие магнитные устройства 24 и создавать тем самым соответственно высокие силы давления.

В биореакторе можно установить расширяющиеся элементы 28, которые могут перемещать в осевом направлении расположенную с возможностью перемещения в сосуде 1 или в крышке 3 пластину 29, аналогично нажимным шайбам 25, и тем самым оказывать на клетки 7 переменные силы давления. В качестве расширяющихся элементов можно применять, например, так называемые металлы или пластмассы с памятью, которые деформируются и снова возвращаются в старую форму. Имеются, например, также пластмассы, которые могут расширяться при электрическом изменении. Элементы с функцией памяти реагируют, например, на определенные температуры или на облучение ультразвуком и тем самым изменяют свое положение, за счет чего вызывается перемещение пластины 30. Можно использовать также пружинные устройства, а также электродвигатели с аккумуляторами или батареями.

Устройство для создания давления на клетки 7 может быть выполнено в виде гидравлического или пневматического устройства 30, которое расположено в сосуде 1, соответственно в крышке 3. Устройство 30 имеет подвижную фольгу, пластину или мембрану 31, за которой находится гидравлическая жидкость или газ в качестве текучей среды. На гидравлическую жидкость или газообразную среду оказывается с помощью нажимного устройства переменное давление, за счет чего на клетки 7 действует переменное давление. Вместо одной упругой пластины или мембраны 31 можно при необходимости применять также баллон для обеспечения большей возможности варьирования. При этом, например, все стенки сосуда на внутренней стороне могут быть окружены таким мешком или баллоном, при этом клетки находятся внутри. За счет этого можно снаружи создавать действующую со всех сторон переменную нагрузку давлением.

Клетки 7 могут помещаться в гель.

1. Биореактор для выращивания клеток, содержащий сосуд, состоящий из цилиндрической средней части и герметично связанных с ней верхней крышки и дна, выполненного в виде нижней крышки, и имеющих по меньшей мере одно отверстие для подвода или отвода питательной среды или кислорода, отличающийся тем, что указанные крышки имеют кольца с резьбой на внутренней поверхности, а цилиндрическая средняя часть сосуда наружную резьбу для образования герметичного резьбового соединения с кольцами крышек.

2. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что крышки и цилиндрическая часть сосуда снабжена уплотнительными кольцами.

3. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что сосуд снабжен зажимными кольцами для его качения или вращения.

4. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что в сосуде расположена платформа для размещения клеток, подвешенная при помощи подвесного устройства к верхней крышке.

5. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что он снабжен устройством для создания давления питательной среды.

6. Биореактор по п.5, отличающийся тем, что указанное устройство представляет собой цилиндропоршневой блок.

7. Биореактор по п.5, отличающийся тем, что устройство для создания давления питательной среды содержит намагничиваемую шайбу, расположенную с возможностью перемещения в сосуде, и средство ее намагничивания.

8. Биореактор по п.7, отличающийся тем, что шайба выполнена в виде решетки, или сетки, или с отверстиями для прохождения питательной среды.

9. Биореактор по п.5, отличающийся тем, что устройство для создания давления питательной среды представляет собой гидравлическое или пневматическое устройство, содержащее фольгу, или пластину, или мембрану, расположенную в сосуде.

10. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что в сосуде расположен гель для размещения в нем клеток.

www.findpatent.ru

BiOENGiNEERiNG - Биореакторы для культур клеток

Биореакторы для культур клеток

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reactors) также решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной ( batch), стационарной с подпиткой ( fed- batch) или непрерывной ( continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост - лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста. Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Компания Bioengineering предлагает большой ассортимент реакторов для обеспечения наилучших условий культивирования различных типов клеток.

Клеточный ферментер - биореактор 

Клеточный ферментер (биореактор) представляет собой резервуар с мешалкой, сконструированный для культивирования клеток животных. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Для минимизации стресса при ранении перемешивание осуществляется лопастной мешалкой морского типа.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Реактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании можно использовать роторные или спиральные фильтры (см. ниже).

Встроенное устройство пробоотбора обеспечивает стерильный отбор контагиозных клеток (например, для производства вирусов).

 

Для того, чтобы не травмировать клетки в процессе продувки можно установить различные системы аэрации, например, пульверизаторы (барбатеры), систему поверхностной аэрации или использовать безпузырьковую продувку через силиконовые трубочки.

Эрлифтный ферментер

В этих ферментерах перемешивание осуществляется потоком воздуха, а не лопастью мешалки, обеспечивая эффективный массоперенос и низкие силы рассечения. Для контроля за циркуляцией жидкости можно установить вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Распределение газа может осуществляться с помощью перфорированных, пористых или гидрофобных трубок. Если клетки могут повредиться пузырьками газа, можно установить систему безпузырьковой аэрации через силиконовые трубочки.

Биореакторы доступны как лабораторные, так и промышленные. Последние имеют широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов.

Компания Bioengineering предлагает также visual safety airlift fermenter с рабочим объемом в 20 л, с легко снимаемой стерилизуемой фольгой вместо стеклянной или стальной оболочки. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные ферментеры подходят для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.

 

 

Биореактор с взвешенной твердой фазой ( Fluidized bed reactor )

Биореакторы, которые поддерживают носители с иммобилизованными клетками в состоянии суспензии, называются реакторами с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reators).

Обычно в этих реакторах присутствует три фазы – твердая, жидкая и газообразная. Для непрерывного культивирования с задержанием биомассы используется специально разработанная система сепарации. Она состоит из различных камер и обеспечивает полное задержание частиц при перфузионных процессах.

Перемешивание достигается с помощью продувки. Это обеспечивает низкий раневой стресс и равномерный массоперенос. Для чувствительных клеток имеется система безпузырьковой аэрации через силиконовые мембраны (Forschungszentrum J?lich (a), Informationsblatt).

Общий объем реактора составляет 7 л, он поставляется как со стеклянным, так и со стальным цилиндром. В этих реакторах была достигнута высокая плотность клеток CHO, BHK и гибридомы (Forschungszentrum J?lich (b), Informationsblatt).

Биореакторы с взвешенной твердой фазой рекомендуются для клеток на микроносителях (т.е. нуждающихся в опорной поверхности), для клеток, чувствительных к раневому стрессу, для заключенных в капсулу клеток и для продуцирования продуктов секреции в долговременной культуре клеток.

Для защиты чувствительных клеток в ферментерах с взвешенной твердой фазой можно использовать систему безпузырьковой продувки через силиконовые трубочки (со стенками, армированными стекловолокном), которая предотвращает возникновение градиента кислорода в потоке.

Автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой (Autoclavable fluidized bed reactor)

Для лабораторных целей удобен автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой ( AWS). Он оборудован магнитным циркуляционным насосом непрерывного действия. Температура контролируется посредством циркуляционного термостата. Ферментер AWS закреплен на раме и может автоклавироваться со всеми аксессуарами.

 

Биореактор с фиксированной твердой фазой (Fixed bed reactor)

Как альтернативу для культивирования клеток, нуждающихся в фиксации для роста, можно использовать биореактор с фиксированной твердой фазой, в котором клетки и их носители захватываются в закрепленную подложку. Эта система не нуждается в сепарационных приемах для удаления жидкой фазы. Раневой стресс и повреждение клеток пузырьками газа минимальны.

В процессе культивирования через фиксированную подложку циркулирует насыщенная кислородом среда. Поэтому при аксиальном потоке длина подложки является критическим параметром, поскольку обеспечение культуры кислородом и питательными веществами может быть недостаточным. В больших реакторах эту проблему можно решить с помощью радиально распространяющегося потока. Среда, обогащенная продуктами метаболизма, удаляется непрерывно или периодически.

Компания Bioengineering предлагает вставные корзины с подложками для маленьких лабораторных ферментеров ( KLF) и лабораторных ферментеров ( NLF, 19 л). Среда через подложки распространяется радиально. Возможно увеличение объема подложки до 40-75 л (500-1000 л реакторы). В таких реакторах выращивают нуждающиеся в имобилизации и чувствительные к ранению клетки. Система подходит и для долговременного выращивания культур клеток с продуктами метаболизма.

Мембранный ферментер

 Мембранный ферментер состоит из внутренней и внешней камер, которые разделены диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую продувку и задержание биомассы при непрерывном культивировании. С помощью мембранной технологии токсические (низкомолекулярные) метаболиты удаляются, а (высокомолекулярные) соединения удерживаются во внутренней камере (P?rtner et al. 1992). Перемешивание в каждой из камер осуществляется мешалкой. Среда и воздух поставляются во внешнюю камеру. Внешняя камера имеет общий объем 7.1 л, а внутренняя – 2.4 л. Биореактор был сконструирован для непрерывного культивирования, но может быть также использован в стационарных и стационарных с подпиткой процессах. Взвешенные клетки, а также клетки, нуждающиеся в закреплении на микроносителях, также могут выращиваться в этом биореакторе (Bohmann et al., 1992; Bohmann et al., 1993).

 

Системы фильтрации

Системы фильтрации используются при непрерывном культивировании клеток животных с задержанием биомассы. Компания Bioengineering предлагает два различных типа фильтров.

Роторный фильтр

 Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы. Второй вариант более гибкий, поскольку в процессе культивирования фильтр может быть демонтирован, промыт, простерилизован и подключен заново. Превосходное задержание биомассы (80% и более) без ее повреждения достигается даже при крупномасштабном культивировании, которое характеризуется долговременностью и высокими скоростями потока (S?meghy).

 

Спиральный фильтр

 

Спиральный фильтр основан на принципе мембранной фильтрации. Он был специально разработан для больших объемов прокачиваемой среды при минимальной затрате энергии (Winzeler 1990).Спиральный фильтр соединяется с биореактором с помощью проточной системы и может стерилизоваться как на месте, так и в автоклаве. Он особенно удобен для задержания клеток, а также для свободного от клеток пробоотбора, поскольку силы травмирования очень малы.

Список литературы

A. Bohmann, R. P?rtner, H. M?rklThe membrane dialysis bioreactor – a reactor concept for continuous cultivation of animal cells. In: DECHEMA Biotechnology and Bioengineering, Vol, 41, 1993, 1092-272

A. Bohmann, R. P?rtner, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl The membrane dialysis bioreactor with integrated radial-flow fixed bed-a new approach for continuous cultivation of animal cells. In: Cytotechnology, 9, 1992, 51-57

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) a Reaktorintegrierte blasenfreie Begasung von Wirbelschichtreaktoren. Informationsblatt des Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o.J.

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) b Integrated bioprocess engineering for antibody production. Informationsblatt des Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o. J.

R. P?rtner, A. Bohmann, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl Metabolic parameters and stability of suspended and immobilized hybridoma cells. In: DECHEMA Biotechnology conferences 5, Frankfurt a. M., 1992, 309-312

Z. S?meghy Improved cell retention system based on the rotating sieve technique. (A copy of the manuscript is available at Bioengineering AG)

H. B. Winzeler Spiral stack membrane module. High performance low energy input membrane separation unit. In: Chimia 44, 1990, 288-291

www.bioengineering.su

Биореактор для культивирования клеток на микроносителях

 

Использование: культивирование клеток животных и человека в суспензиях на микроносителях. Сущность изобретения: биореактор содержит корпус с магнитным приводом и перемешивающим устройством в виде пустотелого цилиндра, при этом биореактор снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, разделяющая полость корпуса на две части. Нижняя часть корпуса соединена трубкой с источником сжатого газа. В указанной перегородке герметично установлены микропипетки, при этом биореактор также снабжен электропневмопреобразователем блока управления для регулирования подачи газа в среду, связанным с атмосферой через пневмодроссель. Система газообмена образована четырьмя цилиндрами с сетчатыми стенками, и цилиндры расположены внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено утолщение с отвертиями, сообщенными с полостью перемешивающего устройства по касательной. 2 ил.

Изобретение относится к аппаратуре для культивирования клеток животных и человека и может быть использовано в биологии, медицине, животноводстве.

Известен биореактор (Gelli Gen проспект фирмы New Brunswick Scientific CO), содержащий корпус с крышкой, перемешивающее устройство, рабочие штуцеры, систему жизнеобеспечения и контроля, перемешивающее устройство, выполненное в виде турбины с плосколопастными или винтовыми мешалками. При перемешивании питательного раствора с клетками такими мешалками клетки ударяются о вращающиеся части и травмируются. Кроме того, степень перемешивания питательной среды с клетками в вертикальном направлении этими устройствами мала, что приводит к неравномерной концентрации питательных продуктов по высоте и ухудшает условия культивирования. Носители, находящиеся в жидкой фазе, с иммобилизованными в них клетками вводят в биореактор с помощью шприца или микропипетки через одно из отверстий в крышке. Процесс этот малопроизводителен и может привести к нарушению стерильности среды. Кроме того, газовая смесь в таком устройстве подается через трубку непосредственно в питательную среду с находящимися в ней клетками, что ограничивает скорость подачи газа и не может обеспечить высокий коэффициент КLA. Наиболее близким к заявляемому решению является биореактор (Gellе Gen проспект фирмы Nen Brunswick Scientific CO), содержащий корпус с крышкой и рабочими штуцерами, систему жизнеобеспечения и контроля, центробежное перемешивающее устройство, устройство для пеногашения. Наличие центробежного перемешивающего устройства обеспечивает интенсивное вертикальное перемешивание питательной среды. Газ подается в объем, заполненный питательной средой, но изолированный от основного объема с клетками сетчатой стенкой. С изолированным объемом связано пеногасящее устройство. Такая конструкция позволяет производить интенсивное насыщение газовой смесью питательной среды и иметь высокий КLA. Однако отсутствие автоматического каплеобразующего устройства, встроенного в биореактор, не позволит произвести заполнение биореактора носителями с иммобилизованными в них клетками за короткое время (1.2 мин), что важно для идентичного развития всех клеток. Кроме того, диаметр капель носителя, превращающихся при соприкосновении со средой в твердые гранулы, не может быть меньше 2.3 мм, в то время как для интенсивного питания клеток этот диаметр должен быть 0,5.1 мм. Другим недостатком этого устройства является возможность травмирования клеток в суспензии или на носителях из-за эффекта "терки" вследствие соприкосновения с сетчатой стенкой, вращающейся со сравнительно большой окружной скоростью. Кроме того, наличие стреловидных трубок (импеллеров), выступающих за цилиндрическую поверхность центробежного перемешивающего устройства, из-за значительной круговой скорости перемешивающего устройства может способствовать травмированию клеток. И, наконец, при периодическом насыщении среды газовой смесью в момент, когда значение давления в аэрационной трубке равно нулю, среда через отверстия попадает в трубку. При подаче в аэратор газа под давлением среда вытесняется из трубки, вызывая при этом интенсивное пенообразование. Целью изобретения является повышение производительности труда при введении носителей с клетками в питательную среду, при одновременном уменьшении травматизма клеток в процессе выращивания и уменьшение степени пенообразования. Это достигается тем, что биореактор для культивирования клеток на микроносителях, содержих блок управления, источник сжатого газа, корпус с термостатирующим устройством и магнитным приводом, крышку, на которой установлены датчики параметров жизнеобеспечения, пробоотборное устройство, конденсатор, а также смонтировано перемешивающее устройство, имеющее форму пустотелого цилиндра, закрепленного на полом валу, на котором установлены устройство пеногашения и система газообмена, изолированная от основного объема сетчатой стенкой, согласно предложенному изобретению снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус с днищем и рабочими штуцерами, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, делящая внутреннюю полость корпуса на две изолированные части, газопроводящей трубкой, соединяющей нижнюю часть корпуса с источником сжатого газа, и микропипетками, каждая из которых герметично установлена в горизонтальной перегородке и свободно с зазором проходит через днище устройства, соединяя верхнюю часть корпуса устройства с внутренней полостью биореактора. Электропневмопреобразователь блока управления для регулирования подачи газовой смеси в среду культивирования связан с атмосферой посредством регулируемого пневмодросселя, соединенного пневматически с полостью электропневмодросселя, в которой размещен электромагнит, а система газообмена образована четырьмя цилиндрами, каждый из которых имеет сетчатую стенку, расположенными внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено цилиндрическое утолщение, снабженное отверстиями, соединенными с полостью перемешивающего устройства касательно. Оснащение биореактора каплеобразующим устройством, корпус которого герметично закреплен на крышке реактора, позволяет сохранить стерильность в процессе работы при введении носителей с клетками в питательную среду. Конструкция каплеобразующего устройства дает возможность получить минимальный диаметр эжектируемых капель до 0,5 мм, что важно для интенсивного питания клеток. С помощью такого устройства можно вводить суспензию клеток с носителями с частотой до 80.100 капель/с, при диаметре капли 0,5 мм из одной микропипетки, т. е. практически одновременно вводится необходимая доза суспензии, что важно для идентичного развития клеток. Подача газовой смеси в реактор осуществляется через электропневмопреобразователь, который соединен с регулируемым пневмодросселем. Это позволяет подавать газ импульсно, не снижая при этом нижний уровень давления газа до нуля. Газ, находящийся в барботажных трубках при минимальном давлении, не дает попасть питательному раствору внутрь трубки через ее барботажные отверстия, что снижает степень пенообразования при подаче верхнего значения давления газовой смеси. То, что газ из барботажных трубок попадает сначала в изолированный от носителей с клетками объем, образованный цилиндрами с сетчатой стенкой, дает возможность значительно увеличивать давление подаваемого газа. Газ растворяется в питательной среде, лишенной клеток, и среда легко проходит через сетку. Конструкция предлагаемой мешалки такова, что, обеспечивая равномерное разбрасывание клеток по всему корпусу, она позволяет уменьшить травматизм клеток за счет отсутствия резко выступающих деталей конструкции. Уменьшению травматизма клеток способствует и то, что сетчатые цилиндры газообмена размещены во внутренней полости мешалки. Проходя в этой полости, клетки двигаются с меньшей примерно в 2 раза круговой скоростью, чем снаружи, следовательно, клетки меньше "трутся" о сетку и меньше травмируются. На фиг. 1 изображена конструкция биореактора для культивирования клеток на микроносителях; на фиг. 2 сечение А-А на фиг. 1, сечение верхней части мешалки. Устройство состоит из следующих основных частей: электронного блока 1 управления, стеклянного корпуса 2, крышки 3. Электронный блок управления содержит магнитный привод 4, стойку с термостатирующим устройством (нагревателем) 5, устройство (систему) 6 для периодической подачи газовой смеси, содержащее электропневмопреобразователь 7, регулируемый пневмодроссель 8 и источник 9 сжатого газа. Через штуцер 10, установленный на крышке 3, сжатый газ через систему 6 по- дачи газа попадает в корпус 2. На крышке 3 установлены конденсатор 11, датчики 12 параметров жизнеобеспечения (рН, РО2, t,оС), пробоотборное устройство 13, каплеобразующее устройство 14, сферический подшипник 15 с валом, на котором смонтировано перемешивающее устройство 16 с системой 17 газообмена и устройство 18 пеногашения, и штуцер 19 для подачи и забора питательной среды. Каплеобразующее устройство 14 содержит корпус 20 с днищем и термостатирующей рубашкой 21, охлаждаемой водой, которую подают перистальтическим насосом (не показан), микропипетки 22, выполненные из полипропилена с оттянутыми кончиками до внутреннего диаметра 0,15 мм, горизонтальную перегородку 23, которая делит корпус 20 на две части нижнюю 24 для прохода газа и верхнюю 25 для смеси носителей с клетками, газоподающую трубку 26, сосуд 27 со смесью и рабочие штуцеры 28 и 29. Каждая микропипетка 22 установлена без зазора в горизонтальной перегородке и проходит через отверстие в днище корпуса, причем для каждой микропипетки в соответствующем отверстии днища предусмотрен зазор 0,5.0,6 мм. Перемешивающее устройство 16 состоит из фторопластового корпуса 30 с вклеенными магнитами 31. В верхней части корпуса 30 выполнены отверстия 32 (фиг. 2), которые соединены с внутренней полостью 33 корпуса 30 по касательной. С корпусом 30 перемешивающего устройства 16 соединено пеногасящее устройство 18. Система 17 газообмена содержит канал 34 для подачи газа, камеру 35 для распределения газа, каналы 36 для подачи газа в барботажные трубки 37, заключенные в цилиндры 38 с сетчатой стенкой, каналы 39 для отвода истощенного газа. Биореактор работает следующим образом. Стеклянный корпус 2 через штуцеры 19 заполняют питательной средой. Включают электронный блок управления. Вращение магнитного привода 4 передается перемешивающему устройству 16 через магниты 31. Включается термостатирующее устройство (нагреватель) 5. В стеклянном корпусе 2 устанавливается температура питательной среды 37оС. Верхняя полость 25 каплеобразующего устройства 14 заполняется жидкой смесью носителей с клетками из сосуда 27 со смесью через штуцер 28. Термостатирующая рубашка 21 поддерживает температуру смеси в корпусе 10. 15оС с помощью циркуляции воды, подаваемой перистальтическим насосом (на фиг. 1 не показано). Через штуцер 29 и газоподающую трубку 26 от источника сжатого газа (на фиг. 2 не показано) в импульсном режиме газ подают в нижнюю часть 24 корпуса 20. Заполнив верхнюю часть 25 корпуса, жидкая смесь попадает в микропипетки, образуя на оттянутых кончиках капли, которые эжектируются газом, проходящим в зазоры между пипеткой и днищем корпуса 20. При соприкосновении с питательной средой при температуре 37оС капля носителей с клетками затвердевают, образуя твердые гранулы, что защищает клетки от травмирования в процессе культивирования. Для обогащения питательной среды газ от источника 9 сжатого газа через систему 6 для периодической подачи газа и штуцер 10 подают в систему 17 газообмена. При этом газ через канал 34 для подачи газа попадает в камеру 35 для распределения газа, откуда через каналы 36 распределится по четырем барботажным трубкам 37, через отверстия в которых выходит в питательную среду. Также барботажные трубки 37 изолированы от основного объема цилиндрами 38 с сетчатой стенкой, внутри которых образуется аэрационная полость, лишенная клеток с носителями, газ растворяется в среде, которая легко проходит через сетку, чтобы среда не попадала в барботажные трубки 37, давление газа при периодической подаче газа не снижается до нуля. Это происходит за счет того, что электропневмопреобразователь 7 системы 6 для подачи газа связан с атмосферой посредством регулируемого пневмодросселя 8, соединенного пневматически с полостью электропневмопреобразователя 7, в которой размещен электромагнит. Регулировкой пневмодросселя 8 устанавливают минимальное давление газа в системе 6 подачи газа. Истощенный газ по каналам 39 поступает в устройство 18 пеногашения, жестко установленное на перемешивающем устройстве 16. В устройстве 18 пеногашения пена "схлопывается" при соприкосновении с сеткой устройства, переходя в жидкое состояние. Вращение перемешивающего устройства 16 вызывает подъем питательной среды, в которой находятся носители с клетками, снизу, по внутренней полости 33 корпуса 30, вверх и выброс через верхние отверстия 32. Подъем происходит за счет небольшого перепада давления во внутренней полости 33, создаваемого вращением четырех отверстий 32. Подъем и выброс через отверстия питательной среды образуют непрерывный циркуляционный контур. Такое движение осуществляет равномерное разбрасывание клеток по всему рабочему объему биореактора и их перемещение не только в горизонтальных, но и вертикальных плоскостях. Продукты испарения из биореактора переходят в конденсатор 11, где, охлаждаясь, конденсируются и возвращаются уже в жидкой фазе в стеклянный корпус 2. Этот процесс уменьшает потери при испарении среды. Контроль за насыщением газом питательной среды с клетками проводят датчиками 12 параметров жизнеобеспечения.

Формула изобретения

БИОРЕАКТОР ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ, содержащий блок управления, источник сжатого газа, корпус с термостатирующим устройством и магнитным приводом, крышку, на которой установлены датчики параметров жизнеобеспечения, пробоотборное устройство, конденсатор и перемешивающее устройство в виде пустотелого цилиндра, закрепленного на полом валу с установленными на нем устройствами пеногашения и системой газообмена, изолированной от основного объема сетчатой стенкой, отличающийся тем, что биореактор снабжен герметично установленным на крышке каплеобразующим устройством, содержащим корпус с днищем и рабочими штуцерами, внутри которого расположена горизонтальная перегородка, разделяющая внутреннюю полость корпуса на две изолированные части, газопроводящей трубкой, соединяющей нижнюю часть корпуса с источником сжатого газа, и микропипетками, каждая из которых герметично установлена в указанной горизонтальной перегородке с возможностью свободного с зазором прохода через днище устройства для каплеобразования и соединения верхней части корпуса устройства с внутренней полостью биореактора, при этом биореактор также снабжен электропневмопреобразователем блока управления для регулирования подачи газовой смеси в среду культивирования, связанным с атмосферой посредством пневмодросселя, соединенного пневматически с полостью электропневмопреобразователя, в которой размещен электромагнит, а система газообмена образована четырьмя цилиндрами, каждый из которых имеет сетчатую стенку, причем цилиндры расположены внутри перемешивающего устройства, в верхней части которого выполнено цилиндрическое утолщение с отверстиями, сообщенными с полостью перемешивающего устройства по касательной.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

www.findpatent.ru

Биореакторы для культур клеток — МегаЛекции

Клетки животных во многом отличаются от микробных и растительных клеток, имеющих клеточные стенки: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток определяют выбор системы перемешивания и аэрации, которые не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать высокий уровень травматизма клеток. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Также используют пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой (fluidized bed reactors).

Для предотвращения повреждения клеток пузырьками воздуха уменьшают объем подаваемой газовой смеси, используют поверхностную продувку или аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в периодической ( batch), периодической с подпиткой ( fed- batch) или непрерывной ( continuous) культуре.

Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с удержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для удержания биомассы и предотвращения ее выноса с культуральной жидкостью используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Клеточный ферментер(компания Bioengineering)

Клеточный ферментер представляет собой резервуар с мешалкой. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Снабжен лопастными мещалками.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным. Реактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании можно использовать роторные или спиральные фильтры.

Встроенное устройство пробоотбора обеспечивает стерильный отбор контагиозных клеток (например, для производства вирусов).

Эрлифтный ферментер

В этих ферментерах перемешивание осуществляется потоком воздуха, а не лопастью мешалки, обеспечивая эффективный массоперенос и низкие силы рассечения. Для контроля за циркуляцией жидкости устанавливают вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Распределение газа может осуществляться с помощью перфорированных, пористых или гидрофобных трубок. Если клетки могут повредиться пузырьками газа, установивают систему безпузырьковой аэрации через силиконовые трубочки.

Биореакторы доступны как лабораторные, так и промышленные. Последние имеют широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные ферментеры подходят для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Биореакторы, которые поддерживают носители с иммобилизованными клетками в состоянии суспензии, называются реакторами с взвешенной твердой фазой (fluidized bed reators).

Обычно в этих реакторах присутствует три фазы – твердая, жидкая и газообразная. Для непрерывного культивирования с удержанием биомассы используется специально разработанная система сепарации. Она состоит из различных камер и обеспечивает полное задержание частиц при перфузионных процессах. Перемешивание достигается с помощью продувки. Это обеспечивает низкий раневой стресс и равномерный массоперенос.

Биореакторы с взвешенной твердой фазой рекомендуются для клеток на микроносителях, для клеток, чувствительных к раневому стрессу, для заключенных в капсулу клеток и для продуцирования целевых метаболитов в долговременной культуре клеток.

Для опорнозависимых клеток можно также использовать биореактор с фиксированной твердой фазой(fixed bed reactor), в котором клетки и их носители захватываются в закрепленную подложку. Эта система не нуждается в сепарационных приемах для удаления жидкой фазы. Раневой стресс и повреждение клеток пузырьками газа минимальны.

В процессе культивирования через фиксированную подложку циркулирует насыщенная кислородом среда. Поэтому длина подложки является критическим параметром, поскольку обеспечение культуры кислородом и питательными веществами может быть недостаточным. В больших реакторах эту проблему можно решить с помощью радиально распространяющегося потока. Среда, обогащенная продуктами метаболизма, удаляется непрерывно или периодически.

В таких реакторах выращивают нуждающиеся в имобилизации и чувствительные к ранению клетки. Система подходит и для долговременного выращивания культур клеток с продуктами метаболизма.

Мембранный ферментер

Мембранный ферментер состоит из внутренней и внешней камер, которые разделены диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую продувку и задержание биомассы при непрерывном культивировании. С помощью мембранной технологии токсические (низкомолекулярные) метаболиты удаляются, а (высокомолекулярные) соединения удерживаются во внутренней камере. Перемешивание в каждой из камер осуществляется мешалкой. Среда и воздух поставляются во внешнюю камеру.

Биореактор сконструирован для непрерывного культивирования, но может быть также использован в стационарных и стационарных с подпиткой процессах. также могут выращиваться в этом биореакторе В таких реакторах также возможно выращивание взвешенных клеток, а также клеткок на микроносителях.

 

Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:

megalektsii.ru

Типы биореакторов

Требования к биореакторам. Для культивирования биологических объектов (бактерии, грибы, культура растительных и животных клеток) используют биореакторы или ферментеры.

Биореактор  - это емкость, в которой создаются условия, обеспечивающие жизнедеятельность биологических объектов.Условия культивирования должны обеспечивать клетки: 1 - необходимыми питательными веществами; 2 - кислородом, а точнее необходимым газовым составом; 3 - стабильным значением рН среды; 4 - поддержанием осмотичности среды; 5 - однородностью состава среды, так как в процессе роста клеток образуются градиенты веществ и продукты жизнедеятельности; 6 - контроль температуры, так как в процессе роста микроорганизмы выделяют 10-14 кДж теплоты на 1 кг сухой массы; 7 - в идеале удалять продукты жизнедеятельности клеток, т. е. обеспечивать постоянство параметров среды. Биореактор  должен быть изготовлен из инертных материалов, например хромоникелевая нержавеющая сталь. Наряду с этим, биореакторы должны удовлетворять следующим требованиям: полная герметизация, исключающая попадания посторонней микрофлоры; сохранение постоянного объема культуральной жидкости, удобство при чистке всех частей аппарата и внутренней поверхности, а также удобство стерилизации.

Принцип работы биореактора достаточно прост, а его устройство и методики сочетания необходимых условий, наоборот, сложны. До помещения в ферментер исходный рабочий продукт – необходимую биологическую культуру – хранят в специальных условиях, так сказать, в неактивном состоянии – например, замораживают. Для культивации небольшую пробу микроорганизмов наращивают в лабораторных условиях до состояния «рабочей порции»- достаточного для динамичной культивации количества. После данного асептического этапа культуру помещают в биореактор, предварительно его поверхность, воздух в камере и все соединительные отверстия стерилизуют, используя для этого водяной пар и вентиляцию. После очистки начинается этап инокуляции – когда помещенные внутрь ферментера культуры начинают активно размножаться и расти, благодаря тому что для них создают оптимальные условия и питательную среду. Конечным продуктом подобных процессов является необходимое количество биомассы или полезные метаболиты микроорганизмов.

В зависимости от конструктивных решений, объемов и других характеристик биореакторы делят на группы.: так на основе рабочего объема биореакторы делятся на лабораторные (их емкость 0,5-100 л), пилотные (100 л-10м3) и промышленные (10-100 м3). Все биореакторы могут быть разделены по используемому принципу культивирования на закрытые и открытые. В закрытых биореакторах осуществляют периодическое культивирование, иногда его называют накопительным культивированием. Систему называют закрытой в том случае, если после начала культивирования ни один из компонентов, участвующих в процессе, не вводится и не выводится из биореактора. Естественно, что в процессе роста все параметры непрерывно изменяются и после накопления конечного (целевого) продукта, реактор разгружается и осуществляется сбор урожая, и культивирование повторяется. Так как в таких условиях истощение среды может происходить достаточно быстро, то возникла модификация этого типа культивирования, получившая название объемно-доливочной системы.

В открытые системы постоянно и равномерно вводят компоненты питательной среды, которые уже использованы культурой, так что бы их концентрация оставалась постоянной, при этом постоянным сохраняется и объем питательной среды. Регулируя концентрацию субстрата, можно поддерживать концентрацию биомассы на постоянном уровне. Такой тип реактора называют турбодистатом. Обоснование выбора реактора может быть основано на знании механизмов регуляции обмена веществ культивируемых клеток.

По способу подвода энергии биореакторы делят на три группы:

1) барботажные с механическим перемешиванием;

2) эжекционные, с самовсасывающей турбинной мешалкой, с внешним циркуляционным потоком;

3) барботажные, форсуночные, колонные, барботажно-эрлифтные.

По способу подачи воздуха в  биореактор   их можно разбить на 2 типа: без подводки стерильного воздуха, в таких биореакторах культивируют анаэробные микроорганизмы; с подводкой стерильного воздуха (их используют для культивирования аэробов).Аэрация жидкости в биореакторах может обеспечиваться механическими мешалками или потоком воздуха.



biofile.ru
Sad4-Karpinsk | Все права защищены © 2018 | Карта сайта