Новый метод выделения РНК для обнаружения вирусов. Выделение рнк из растений

Способ экстракции рнк из растительных образцов

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экстракции рибонуклеиновой кислоты (РНК) из растительных образцов различного происхождения. На этапе гомогенизации растительных образцов в лизирующий буфер, содержащий 4 М гидрохлорид гуанидина, 0,2 М ацетат натрия, 25 мМ ЭДТА, 2,5% поливинилпирролидон, 20% саркозил, добавляют гидроксипроизводное бензойной кислоты в количестве 20-30 мг на образец. Способ позволяет повысить эффективность выделения РНК, что способствует более успешному протеканию ПЦР и выявлению вирусов в растительном материале. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экстракции рибонуклеиновой кислоты (РНК) из растительных образцов различного происхождения.

Известен способ экстракции рибонуклеиновой кислоты (РНК) из растительных образцов для последующей диагностики вирусов методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) (Rwahnih M. Al et al. Molecular variability of Apple Chlorotic Leaf Spot Virus in different hosts and geographical regions // Journal of Plant Pathology. - 2004. - 86 (2). - P.117-122). Данный способ применяется для выявления вируса хлоротической пятнистости листьев яблони в различных плодовых культурах и предусматривает гомогенизацию растительных образцов в лизирующем буфере, содержащем 6 М гидрохлорида гуанидина, 0,2 М ацетата натрия, 1 М ацетата калия, 25 мМ ЭДТА и 2,5% поливинилпирролидона (ПВП).

Однако данный, несомненно, прогрессивный способ характеризуется недостаточно высокой эффективностью экстракции РНК из образцов при диагностике других вирусов, что связано с отсутствием применения антиоксидантов. В соке плодовых и ягодных культур содержатся высокие количества фенольных соединений, полисахаридов и других ингибирующих ферменты веществ, препятствующих получению препаратов нуклеиновых кислот.

Использование соединений с антиоксидантной активностью позволяет удалять ингибиторы ферментов из растительных экстрактов.

Известно применение гидроксипроизводного бензойной кислоты в составе фосфатного буфера для заражения травянистых растений-индикаторов соком исследуемых растений (Патент РФ №2147173, МПК А01Н 1/04/ Упадышев М.Т., Петрова А.Д. Способ тестирования растений на вирусы. - Заявл. 02.12.1998. - Опубл. 10.04.2000. - Бюл.№10).

Однако назначение препарата, задачи и способы их достижения в предлагаемом способе отличаются от известных способов. К тому же диапазон концентраций гидроксипроизводного бензойной кислоты в предлагаемом способе иной, чем в известном (1×10-5-5×10-4 М в известном способе, тогда как в предлагаемом способе диапазон концентраций составляет 20-30 мг/образец).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ экстракции РНК из растительных образцов, при котором для повышения эффективности выявления вирусов к лизирующему буферу, содержащему 4 М гидрохлорида гуанидина, 0,2 М ацетата натрия, 25 мМ ЭДТА, 2,5% поливинилпирролидона, 20% саркозила, в качестве антиоксиданта добавляют метабисульфит натрия в концентрации 1% (Habili N., Afsharifar A., Symons R.H. First detection of an ampelovirus, a maculavirus and two vitiviruses in Iranian table grapes // 14th ICVG Conference, Locorotondo, 12-17th September, 2003. - P.162-163 - прототип).

Недостатком этого известного способа является то, что он разработан применительно к вирусам винограда, и на других культурах экстракция РНК происходит с меньшей эффективностью.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение эффективности экстракции РНК из растительных образцов и последующей диагностики вирусов методом полимеразной цепной реакции.

Поставленная задача решается тем, что в способе экстракции РНК из растительных образцов для последующей диагностики вирусов методом полимеразной цепной реакции, включающем гомогенизацию растительных образцов в лизирующем буфере, новым является то, что на этапе гомогенизации добавляют гидроксипроизводное бензойной кислоты в количестве 20-30 мг на образец.

Технический результат выражается в том, что после добавления к лизирующему буферу гидроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20-30 мг на образец происходит повышение эффективности экстракции РНК, что способствует более успешному протеканию ПЦР и выявлению вирусов в растительном материале.

Отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом является использование гидроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20-30 мг на образец на этапе гомогенизации.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить отсутствие технического решения в источниках, характеризующихся признаками, тождественными признакам заявленного изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить в заявленном способе совокупность существенных отличительных признаков по отношению к усматриваемому техническому результату, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».

Результаты проверки проведенного дополнительного поиска известных решений показали, что заявляемый способ имеет «изобретательский уровень», и для специалистов суть заявленного не является очевидным и явным образом не вытекает из известных способов, а является результатом исследований и творческого труда авторов изобретения.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1.

ПЦР-тесты проводят с праймерами и реакционными смесями, разработанными в ООО "Агродиагностика", а также с праймерами, синтезированными в компании "СибЭнзим", наборами для ОТ-ПЦР компании "Биоком". При проведении ОТ-ПЦР амплификацию выполняют на программируемом термостате «Терцик», а регистрацию результатов осуществляют на трансиллюминаторе Vilber Lourmat TCP-20. МС с выводом изображений электрофореграмм ПНР-продуктов на компьютер.

Экстракцию РНК осуществляют следующим образом:

1. Берут навеску растительного образца (листья, кору, древесину) в количестве 0,1 г в соотношении 1:15 с буфером, содержащим 4 М гидрохлорида гуанидина, 0,2 М ацетата натрия, 25 мМ ЭДТА, 2,5% поливинилпирролидона, 20% саркозила.

2. Осуществляют гомогенизацию образца в ступке, в которую добавляют гидроксипроизводное бензойной кислоты по 20-30 мг/образец.

3. В промаркированные пробирки (эппендорфы) добавляют по 600 мкл растертого образца + 120 мкл додецилсульфата натрия, тщательно перемешивают и термостатируют на термошейкере при 70°С в течение 10 минут.

4. Перемещают пробирки на лед на 5-10 минут.

5. Центрифугируют в течение 10 минут при 13000 оборотах/мин.

6. Маркируют необходимое количество чистых пробирок.

7. Отцентрифугированный образец в количестве 300 мкл переносят в чистые пробирки.

8. Добавляют по 300 мкл йодида натрия +150 мкл абсолютного этанола +50 мкл силики (тщательно перемешанной).

9. При комнатной температуре встряхивают в течение 20 минут на термошейкере при 1400 об/мин.

10. Центрифугируют 1 мин при 6000 об/мин.

11. Готовят смесь 1:1 из абсолютного спирта и буфера STE.

12. Промывают вышеуказанной смесью образцы (наносят по 500 мкл смеси), центрифугируют 1 мин при 6000 об/мин, надосадочную жидкость сливают.

13. Пункт 11 повторяют.

14. К осадку добавляют 150 мкл воды, перемешивают на вортексе.

15. Термостатируют в течение 4 мин при 70°С.

16. Образцы центрифугируют в течение 5 минут при 13000 об/мин.

Образец РНК готов для проведения обратной транскрипции.

Обратную транскрипцию проводят с применением готовых наборов, предложенных компанией «Агродиагностика». Для этого готовят ОТ - смесь в расчете на 1 образец: в отдельной пробирке 5 смешивают 2,0 мкл ОТ-буфера; 1,0 мкл ОТ-дНТФ и 0,5 мкл MMLV-обратной транскриптазы. В промаркированные пробирки по 0,6 мл вносят по 3,5 мкл От-смеси. После чего переносят пробирки в зону пробоподготовки. Вносят в пробирки по 16,6 мкл образца, встряхивают на вортексе 3-5 сек, осаждают капли кратковременным центрифугированием. Термостатируют пробирки при 40°С в течение 40 мин, затем инактивируют обратную транскриптазу прогреванием при 95°С в течение 10 минут. Далее осаждают капли кратковременным центрифугированием. Полученный кДНК готов к внесению в реакционную смесь для постановки ПЦР.

Для постановки ПЦР используют набор реагентов «ПЦР-ядро» компании «Биоком». В необходимое количество промаркированных пробирок вносят по 5 мкл смеси праймеров (концентрация 0,1-0,5 мкМ), 10 мкл ПЦР-растворителя, 5 мкл готовой кДНК. В качестве отрицательного контроля следует использовать бидистиллированную воду. Во все пробирки добавляют по 20 мкл минерального масла. Переносят пробирки в термоблок программируемого термостата «Терцик» и осуществляют амплификацию.

Для экспериментов были подобраны образцы груши, заведомо содержащие вирусы. Как показывают результаты (табл.1, фиг.1), при выполнении ОТ-ПЦР на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони и бороздчатости древесины яблони на груше с применением способа экстракции РНК в соответствии с прототипом оба вируса не удалось диагностировать (образец 5 на фиг.1), тогда как при добавлении гидроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20 (образец 2) или 30 мг/образец (образец 3) вирусы успешно детектировались.

Более низкая (10 мг) (образец 1) и высокая (40 мг) (образец 4) концентрации гидроксипроизводного бензойной кислоты были неэффективными.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1. Для проведения ПЦР в реальном времени на этапе амплификации используют систему «Мини-Оптикон» (США) с выводом результатов амплификации в виде графиков флуоресценции на монитор компьютера.

Как видно из таблицы 2, наработка ПЦР-продукта при диагностике растений сливы на вирус шарки в способе выделения по прототипу начинается позже, чем в предлагаемом способе при использовании гидроксипроизводного бензойной кислоты в концентрации 20 или 30 мг/образец.

Так, в опыте 1 наработка продукта в предлагаемом способе (20 или 30 мг ГПБК) начиналась уже на 10 цикле амплификации, тогда как в прототипе - только с 24 цикла, что свидетельствует о более низкой эффективности известного способа. Экстремум репортерной флуоресценции в предлагаемом способе был на 19-37% выше (фиг.2, линии 1 и 2) по сравнению с прототипом (линия 4). Репортерная флуоресценция прямо пропорциональна количеству ПЦР-продукта и, соответственно, концентрации вируса. Высокие значения флуоресценции свидетельствуют о более успешной экстракции РНК и более корректной оценке зараженности образцов вирусами.

Указанная закономерность по преимуществу разработанного способа имела место и в опытах 2 и 3. В опыте 2 в предлагаемом способе (20 или 30 мг ГПБК) наработка ПЦР-продукта начиналась с 10 цикла амплификации, в прототипе - с 12-го. Значения репортерной флуоресценции в прототипе были на 6-19% ниже по сравнению с предлагаемым способом. В опыте 3 наработка ПЦР-продукта при использовании разработанного способа начиналась с 13-15 цикла амплификации, в прототипе - с 19-го. Экстремум репортерной флуоресценции в предлагаемом способе в 1,9-2,0 раза превышал соответствующий показатель в прототипе.

Таким образом, экстракция РНК по предлагаемому способу происходит более успешно, что приводит к повышению эффективности выделения РНК из растительных образцов и последующей диагностики вирусов методом полимеразной цепной реакции и выражается в случае ОТ-ПЦР в более достоверном выявлении вирусной инфекции, а при проведении ОТ- ПЦР в реальном времени - в более ранней наработке ПЦР-продукта (с 10-15 цикла в отличие от 12-24 цикла в прототипе) и более высоких значениях репортерной флуоресценции (в среднем на 45% выше) по сравнению с прототипом.

Способ экстракции РНК из растительных образцов для последующей диагностики вирусов методом полимеразной цепной реакции, включающий гомогенизацию образцов в лизирующем буфере, содержащем 4 М гидрохлорида гуанидина, 0,2 М ацетата натрия, 25 мМ ЭДТА, 2,5% поливинилпирролидона, 20% саркозила, отличающийся тем, что на этапе гомогенизации добавляют гидроксипроизводное бензойной кислоты в количестве 20-30 мг/образец.

www.findpatent.ru

Выделение нуклеиновых кислот из растений

    Получение препаратов НК из растений, особенно из дифференцированных тканей, осложняется низким содержанием НК. при наличии высокоактивных нуклеаз, обилием углеводных компонентов, полифосфатов, вакуолей и трудностью разрушения клеточных оболочек. При выделении нуклеиновых кислот из растений нео бходимо уделять особое внимание ингибиции нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от сопутствующих примесей. [c.53]

    Настоящая книга, издаваемая в серии научных трудов ВИР, освещает методы и методики по определению содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях и препаратах. В ней также изложены — идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов выделение нативных РНК и ДНК из растений фракционирование их на колонках определение нуклеотидного состава РНК и ДНК методами колоночной и бумажной хроматографии изучение свойств макромолекул нуклеиновых кислот, обнаружение их в клетке, цитофотометрия, определение состояния ДНК и РНК в клетке. [c.2]

    Кроме клонирования и конструирования генов методы выделения нуклеиновых кислот и их анализа служат составной частью многих процедур, используемых для определения структуры и экспрессии трансфицируемых генов как в культурах трансформированных клеток растений, так и в целых регенерированных растениях. [c.236]

    Дрейпер Дж,у Скотт Р, Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений // Генная инженерия растений. М Мир. 1991. С.236 - 276. [c.126]

    Таким образом, растения при фотосинтезе запасают энергию и связывают углерод в виде D-фруктозо-б-фосфата, из которого затем синтезируют сахарозу и крахмал. Сахароза хорошо растворяется в воде и транспортируется в различные части растения, крахмал используется в качестве резервного полисахарида. Сахароза и крахмал легко гидролизуются, образующиеся при этом D-глюкоза и D-фруктоза служат исходньпки материалами для биосинтеза других моно-, олиго- и полисахаридов. D-Глюкоза и D-фруктоза подвергаются также расщеплению и окислению с выделением необходимой для жизнедеятельности растения энергии и образованием промежуточных соединений для последующего биосинтеза (ацетилкофермент А, D-эpитpoзo-4-фo фaт, фосфоенолпировиноградная кислота, рибозо-5-фосфат). На основе этих веществ растения синтезируют многочисленные представители различных классов соединений (лигнины, липиды, таннины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, терпены, пигменты, алкалоиды, фитогормоны и т.д.). Растительная биомасса является обширным возобновляемым сырьевым источником для производства различных органических материалов и соединений. [c.341]

    На рис. 7.1 приведена схема типичного эксперимента по клонированию молекул ДНК. Первый этап-это выделение в чистом виде нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющую интерес функцию, из ее природного хозяина. Из бактерий и других прокариотов необходимую ДНК часто можно выделить непосредственно. Для высших растений и животных процедура выделения несколько отлична, поскольку их ДНК включает последовательности, известные как интроны. Интроны представляют собой имеющиеся в генах нуклеотидные последовательности, исключаемые из матричной РНК ( этот процесс называют сплайсингом) в промежутке между транскрипцией и трансляцией (рис. 7.2). Чтобы интересующий нас ген мог быть экспрессирован в прокариотах, интроны необходимо исключить (рис. 7.3). С этой целью сначала [c.89]

    Во-вторых, работа с биохимическими объектами, которая касается не только методов выделения и очистки, но и многочисленных исследовательских работ с ними, особенно с белками и нуклеиновыми кислотами, заключается в необходимости манипулировать с очень маленькими количествами вещества — миллиграммами, микрограммами и даже значительно меньшими. При выделении это связано с незначительным содержанием многих компонентов в исходной биомассе, а также в ряде случаев с ограниченным количеством биомассы, например при исследовании редко встречающегося животного или растения или очень мелких живых объектов, которые иногда добываются поштучно и доступны в небольшом числе. [c.231]

    Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов некоторых видов растений. В отдельных экспериментах по трансформации может понадобиться анализ геномной ДНК (как ядерной, так и ДНК органелл) для выявления перенесенных последовательностей. В данной главе описаны методы выделения как небольших количеств нуклеиновых кислот, так и процедуры их крупномасштабного выделения. Эти методики нашли широкое применение для получения тотальной клеточной ДНК, а также ДНК из ядер и органелл. [c.238]

    Молекулярный вес отдельных нуклеиновых кислот также различается довольно резко. Оказалось, что молекулярный вес ДНК, выделенной из ядер различных клеток растений, животных и микроорганизмов, весьма близок и обычно составляет-6—8 миллионов, т. е. в состав ДНК входит приблизительна 20 ООО—25 ООО отдельных мононуклеотидов. Молекулярный вес рибосомальной РНК может достигать 1,2—1,5 миллионов. Мо- [c.230]

    Недавно считалось, что специфичными для данного организма являются белки, что только белки, выделенные из отдельных органов и тканей организмов различных видов, обладают постоянством состава, строения и свойств. Однако детальное исследование нуклеотидного состава ДНК и РНК различных высших и низших растений, животных, а также микроорганизмов, которое проводилось главным образом в лабораториях Чаргаффа и советского ученого А. Н. Белозерского, показало, что специфичностью обладают также и нуклеиновые кислоты. [c.231]

    Нуклеопротеиды представ.ляют огромный интерес и потому, что к этой группе белков принадлежат вирусные белки, причисляемые некоторыми учеными к неклеточ-нон форме жизни. Так, выделенный из пораженного мозаичной болезнью табака специфический нуклеопротеид представляет собой вне организма белок, который может быть получен в кристаллическом состоянии, многократно перекристаллизован, очищен и т. д. По всем своим свойствам оп является определенным химическим соединением. Однако при введении в организм растения этот белок начинает вести себя, как настоящее живое патогенное начало количество его быстро нарастает, увеличиваясь в десятки и даже сотни раз. По-видимому, в основе этого размножения лежит извращенный синтез белка клетками зараженного организма, который приводит к появлению новых вирусных частиц. Растение при этом заболевает и, в конце концов, погибает. Основную роль в патогенности указанных вирусных белков, по-видимому, играют нуклеиновые кислоты. Френкель-Конрату удалось отделить нуклеиновую кислоту кристаллического вируса от белка, причем каждый компонент в отдельности был неактивен или малоактивен, однако если смешать нуклеиновую кислоту с белком, то такой искусственно изготовленный, реконструированный вирусный белок об.падает исходными патогенными свойствами. [c.54]

    Молекулярный вес полученных препаратов целлюлозы колеблется в пределах приблизительно от 50 ООО до >10 . Следует заметить, что молекулы целлюлозы, так же как и молекулы нуклеиновых кислот, легко распадаются в процессе выделения и, следовательно, указанные молекулярные веса могут быть значительно занижены. Так или иначе, в клеточных стенках растений целлюлоза присутствует не в виде индивидуальных молекул, а в виде микрофибрилл длиной в несколько сот ангстрем. Фибриллы образуются из многочисленных цепей целлюлозы, располагающихся параллельно друг другу. [c.266]

    Все упомянутые выше методы очистки нуклеиновых кислот при использовании в качестве исходного материала клетки бактерий, животных или растений дают в руки исследователей сложную смесь генов и некодирующих нуклеотидных последовательностей. Для выделения конкретных последовательностей нуклеотидов и работы с ними необходимо использовать многочисленные ферменты. Свойства некоторых ферментов, широко используемых в генной инженерии, кратко рассмотрены ниже. [c.48]

    Глава 4. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. Дж. Дрей пер, Р. Скотт............ [c.4]

    Соответствующий трипептид — офтальмовая кислота (21), присутствующая в хрусталике млекопитающих, возможно, осуществляет подобную функцию [51]. Большое количество разных у-глу-тамильных пептидов найдено в растениях [52, 53], однако значение этих веществ до конца не выяснено. Из Е. соИ [541 выделен глута-тионилспермидин (22) предложено, что это соединение может иметь значение для контроля роста и метаболизма нуклеиновых кислот. [c.298]

    Вирусы относятся к ультрамикробам, которые настолько малы, что проходят через мембранные фильтры, задерживающие обычные бактерии. Так, размер частиц вируса полиомиелита составляет 8—17 нм, вируса Коксаки и E HO — 20—30 нм, инфекционного гепатита — 40-56 нм. Вирус полиомиелита выделен также в форме кристаллического протеина, обладающего инфекционными свойствами. Для вирусов характерны отсутствие клеточного строения, простота химического состава (обычно гидратированный белок и специфическая нуклеиновая кислота), своеобразие обмена веществ (не имея своей ферментативной системы, они являются паразитами живой клетки животных и растений). Вирусы не размножаются на искусственных питательных средах накапливаются они и проходят определенный цикл развития в соответствующих живых клетках. Действие многих антибиотиков и химиотерапевтических веществ на них малоэффективно. [c.186]

    Рассмотренные пуриновые и пиримидиновые основания, а также некоторые другие производные пурина и пиримидина, которые не входят в состав нуклеиновых кислот, часто содержатся в растениях в значительном количестве в свободном состоянии. Наиболее часто в свободном состоянии в растениях встречаются гипоксантин (6-оксипурин), который был выделен из семян горчицы и люпина, ксантин (2,6-диоксипурин), найденный в листьях растений, мочевая кислота (2,6,8-триоксипурин), впервые выделенная А. В. Благовещенским из семян кормовых бобов и позднее обнаруженная в других растениях, а также аллантоин (глиоксилдиуреид), очень широко распространенный в растениях. Ниже представлены схемы строения этих оснований  [c.225]

    Белки вирусов. — Вирус —субмикроскопическое инфекционное тело, которое проходит сквозь фильтр (Беркфельд), задерживающий любую известную живую клетку. Вирусы способны к аутокаталитическому росту и размножению в живых тканях и рассматривались в свое время как наименьщие известные живые организмы. Один из вирусов, вирус табачной мозаики, присутствующий в отфильтрованном соке растений, зараженных табачной мозаикой, был выделен Стенли в кристаллической форме (1935). Установлено, что он является нуклеопротеидом. Его молекулярный вес необычно высок (40 миллионов), содержание нуклеиновой кислоты 6% по весу. Кристаллический нуклеопротеид весьма инфекционный, его вирусная активность почти параллельна зависимости стабильности от pH. Вещество способно к самовоспроизведению в табачных листьях из растений, зараженных 1 мкг вируса, выделено 2—3 г вируса. После работ Стенли было найдено значительное число растительных вирусов и показано, что все они являются нуклеопротеидами (огуречная мозаика, вирус кустистости томатов, картофельный х-вирус, вирус кольцевых пятен табака). [c.727]

    В последнее время определены молекулярные веса РНК и ДНК, выделенных в высоконолимерном состоянии с сохранением соответствующих биологических свойств из клеток различных микроорганизмов и тканей животных и растений, а также вирусов. Оказалось, что обе нуклеиновые кислоты обладают очень высоким молекулярным весом. Так, для РНК были найдены величины до 1,5—2 млн. Такие молекулы слагаются из 4—6 тыс. отдельных нуклеотидов. Для ДНК клеточного ядра определен еще больший молекулярный вес. Так, в нативных препаратах ДНК, где она в какой-то мере сохранила состояние, присущее ей в клетке, величины молекулярного веса составили [c.46]

    Ядро характеризуется высоким содержанием нуклеиновых кислот. В связи с этим, а также вследствие важной функциональной роли ДНК и РНК в клетке выделение и определение этих нуклеиновых кислот относится к числу наиболее важных методов биохимии ядер. Для выделения и определения нуклеиновых кислот разработано много методов. Ниже приведены те из них, которые используются при работе с высшими растениями. ДНК можно выделить в чистом виде из хроматина путем депротеинизации по методу Мармура [36] согласно этому [c.31]

    Было проанализировано большое число препаратов нуклеиновых кислот (пока неоднородных из-за несовершенства методов выделения) животных, растений, микроорганизмов, а также ряд нуклеиновых кислот вирусов некоторые характерные результаты приведены в табл. 6-2. Так как многие из исследованных препаратов представляют собой сложные смеси нуклеиновых кислот различных биологических функций, в разной степени подверженных как внеклеточному, так и внутриклеточному распаду (некоторые виды рибонуклеиновой кислоты, метаболически очень активные, обладают высокими скоростями обмена, и нельзя пренебрегать возможностью существования внутри клетки значительных количеств недостроенных рибонуклеиновых кислот), то неудивительно, что не наблюдается четких количественных соотношений, даже если они и действительно существуют in vivo. Представляет, однако, некоторый интерес то, что рибонуклеиновая кислота из дрожжей, наиболее широко изученная первыми исследователями, все же. [c.404]

    Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

    С биологической точки зрения наиболее важными комплексами являются рибонуклеопротеиды. Мало известно о природе химической связи между нуклеиновой кислотой и белком, хотя во многих нуклеопротеидах, таких, как кристаллические вирусы растений, компоненты расположены определенным образом, когда нуклеиновая кислота окружена защитной белковой оболочкой. Рентгенографические исследования рибонуклеонротеидных частиц клеточного происхождения и полученных из них рибонуклеиновых кислот позволяет предположить, что конформация рибонуклеиновой части комплекса определяется белковой матрицей [280]. Обратимая диссоциация высокомолекулярных рибонуклеонротеидных субъединиц происходит легко [281] образование связей обусловлено, по-видимому, действием ряда сил. Последние включают кулонов-ское притяжение противоположно заряженных ионов, притяжение диполей и водородные связи. Убедительное доказательство наличия иных связей, кроме электростатических, было получено путем электрофоретического изучения рибонуклеопротеида, рибонуклеиновой кислоты и белка и изучения влияния обработки мочевиной на электрофоретическое поведение рибонуклеопротеида — прием, обычно используемый для ослабления водородных связей [282]. Соотношение рибонуклеиновой кислоты и белка в выделенных рибонуклеопротеидах значительно варьирует в случае наиболее строго [c.413]

    За последние годы твердо установлено, что нуклеиновые кислоты выполняют в вирусе, клетке и в макроорганизме кибернетические функции. В дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) клеточных ядер и рибонуклеиновой кислоте (РНК) вирусов растений зафиксирована вся генетическая информация, т. е. необходимые данные для синтеза белков. Прямые опыты по трансформации бактерий растворами чистой ДНК, но заражению бактерий с помощью ДНК, выделенной из фагов, по заражению растений с помощью РНК, выделенной из вирусов, показывают, что именно макромолекулы ДНК и РНК являются носителяйи генетической информации. Если искать сравнение из области электронных счетно-решающих машин, то можно, как это делал Нейман, рассматривать по аналогии с клеткой машину, содержащую все необходимое, чтобы воспроизвести самое себя. В такой машине должны быть рабочие орудия (в клетке—это ферменты, организованные в пространственные структуры) и должен быть элемент памяти (например, магнитная лента), в котором зафиксированы с помощью кода все детали ее конструкции. Цепочка нуклеиновой кислоты играет в клетке ту же роль, что магнитная лента в электронной машине. Чем длиннее цепь нуклеиновой КИС.ЛОТЫ, тем больше информации в ней может быть запасено. [c.6]

    Дискретность и целостность. Жизнь характеризуется диалектическим единством противоположностей, она одновременно и целостностна и дискретна (от лат. упрощенной схеме это можно представить так животные-хищники для своего питания нуждаются в существовании растительноядных, живот-ные-растительноядные—в существовании растений, растения в процессе фотосинтеза поглощают из атмосферы СОг, выделение которого в атмосферу связано с жизнедеятельностью живых организмов кроме того, растения из почвы получают ряд минеральных веществ, количество которых не истощается благодаря разложению органических веществ, осуществляемому бактериями, и т. д. Органический мир целостен, так как составляет систему взаимосвязанных частей, и в, то же время он дискретен. Ои состоит из единиц—организмов, или особей. Каждый живой организм дискретен, так как состоит из органов, тканей, клеток, но вместе с тем каждый из органов, обладая определенной автономностью, действует как часть целого. Каждая клетка состоит из органоидов, но функционирует как единое целое. Наследственная информация осуществляется генами, но ни один из генов вне всей совокупности не определяет развитие признаков и т. д. Идя далее, следует сказать, что жизнь связана с молекулами белков и нуклеиновых кислот, но только их единство, целостная система обусловливает существование живого. [c.13]

    Нуклеопротамины были получены из спермы рыб, нуклеогистоны — из зобной железы и других тканей млекопитающих. Содержание нуклеиновых кислот в этих нуклеопротеидах колеблется от 31 до 66% [245]. Нуклеопротеиды, выделенные из растений или из бактерий, не содержат ии протаминов, ни гисто-иов в их состав входят только истинные белки [285]. Такие же истинные нуклеопротеиды были найдены в тканях животных (см. гл. XVII). [c.264]

    Методы, используемые на третьей стадии, практически одинаковы для нуклеиновой кислоты данного типа выделение специфической тРНК одно и то же, будь то тРНК из дрожжей, бактерий, растений или клеток млекопитающих. Точно так же способ выделения рибосомных РНК из рибосом, по с5гществу, но зависит от источника рибосом. [c.224]

    Кроме того, микрометоды (разд. 4.2.3.1 и 4.3.3.2) выделения, тотальной ДНК из трансформированных клеток растений позволяют получить предварительные данные о ее организации. Для таких методов требуется всего лишь 20 мг лиофилизиро-ванной либо 0,5 г свежей растительной ткани, а очистка в градиенте плотности СзС1/БЭ не применяется. Выделенная ДНК имеет достаточно большую мол. массу, однако сильно загрязнена РНК и в меньшей степени полисахаридами. Концентрацию нуклеиновой кислоты в таких неочищенных препаратах невозможно определить спектрофотометрически, однако содержание ДНК может быть определено достаточно точно очень чувствительным методом с использованием дифениламина (разд. 4.6). [c.238]

    В 1955 г. Грюнберг-Маиаго и Очоа осуществили in vitro синтез полирибонуклеотидов из рибонуклеозид-5 -дифосфатов под действием фермента полинуклеотидфосфорилазы (полирибонуклеотид—нуклеотидил-трансферазы), выделенного ими из микроорганизмов и впоследствии обнаруженного в клетках растений и животных Первоначальное предположение, что данная реакция лежит в основе синтеза РНК в клетке, в дальнейшем не подтвердилось. Под действием полинуклеотидфосфорилазы полимеризация нуклеозиддифосфатов происходит беспорядочным образом и приводит к гомо- и гетерополимерам, не обладающим специфической нуклеотидной последовательностью. Состав полимеров определяется в основном соотношением исходных нуклеозиддифосфатов Полученные таким путем высокополимерные полинуклеотиды заданного состава широко используются для выяснения макроструктуры нуклеиновых кислот и при изучении нуклеотидного кода для синтеза белка. [c.441]

    Было показано также, что в процессе экстрагирования вирусных нуклеиновых кислот и отделения их от белка может происходить комплексирование в действительности одноценочечных комплементарных молекул, так что обнаруживаемая двухцепочечность может быть на деле артефактом, связанным с фенольным или детергентным методами выделения внутриклеточной РНК. Были получены данные в пользу гипотезы, что матричная (—)-цень удерживается в комплексе с возникающей (4-)-цепью в основном не за счет спаривания оснований, а каким-то менее жестким способом, возможно с помощью молекул репликазы [117, 549]. Именно выраженной способностью образующейся РНК действовать в качестве информационной РНК и связываться с рибосомами, может быть, и объясняется быстрое снятие этой цепи с матрицы. Наряду с этими данными, однако, в последнее время были получены новые данные о существовании РФ- и РПФ-форм РНК у фагов и вирусов растений [25, 46, 221]. Проведенный недавно анализ образующихся 5 -концевых групп [c.241]

    При разложении азотсодержащие продукты метаболизма растений и животных (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, пурины, пирими-дины и др.), ткани отмерших организмов подвергаются минерализации, гниению с выделением аммиака. Разложение микроорганизмами азотсодержащих веществ, сопровождающееся образованием ионов аммония и аммиака, называется аммонификацией. Как в аэробных, так и в анаэробных зонах экосистем аммонификация осуществляется различными микроорганизмами и при участии выделяемых ими протеолитических ферментов. Выделяющийся аммиак частично ассимилируется растениями и микроорганизмами, улетучивается в атмосферу, сорбируется на глинистогумусовых компонентах почвы. [c.62]

    Препараты нуклеиновых кислот необходимы для идентификации и выделения генов в процессе генно-инженерных манипуляций, а также для изучения организации и экспрессии генов на молекулярном уровне в трансформированных растениях, В первом случае высокомолекулярная очищенная ДНК и интактная РНК необходимы для получения соответственно геномных библиотек и библиотек ДНК. Подробно методики клони-)ования генов и их анализа описаны в других пособиях [1, 8], 7осле того как изучаемый ген клонирован и его структура установлена, его можно ввести в растения (в неизменном или модифицированном виде) с помощью векторов типа DMGT или векторов, сконструированных на основе Ti-плазмид (гл. 1,2 и 3). [c.236]

    Изолированные корни кукурузы выделяли аминокислоты,, корни интактных проростков кукурузы тоже, ио в значительно меньшей степени, причем выделение различных аминокислот корнями зависело от содержания азота в питательном субстрате и аэрации среды. Изолированные корни пшеницы выделяли в культуральную среду аминокислоты (пролнп, -у-аминомасля-ную кислоту), которые непосредственно в корне обнарул ены ие были. Таким образом, корневые системы многнх растений выделяют во внешнюю среду минеральные вещества, спирты, сахара, органические кислоты, аминокислоты и амиды, ферменты, нуклеиновые кислоты, фенольные соединения, сапонины и другие соединения, что является нормальной физиологической функцией, нормальным проявлением их жизнедеятельности и может значительно изменяться под влияиием внешних факторов. [c.321]

chem21.info

2.2. Выделение рнк

Выделение РНК и ПЦР проводились в лаборатории экологического биомониторинга МГГУ им. М.А.Шолохова.

Работа проводилась в резиновых перчатках во избежание попадания Рназ кожи рук в препараты ДНК.

Стеклянная посуда была прокалена при +1600С в течении 4часов. Пластиковая посуда автоклавировалась в дистиллированной воде.

Клетки для исследования транспортировались в РНК-сохраняющем растворе EverFresh в соотношении 1:3. Перед началом выделения РНК клетки осаждались центрифугированием, супернатант удалялся.

Выделение рнк из клеточной культуры набором «YellowSolve»

Реактивы:

1. Лизирующий раствор YellowSolve

2. Хлороформ

3. Депротеинизирующий раствор GгееnСlеап

4. Этиловый спирт 96%

5. Этиловый спирт 80%

Оборудование:

Ход работы:

Суспензию культуры клеток гомогенезировали в 1 мл лизирующего раствора YellowSolve до полного исчезновения комочков клеточного материала. 100мкл суспензии содержали приблизительно10млн клеток.

Лизат центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и пр. Прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку.

К супернатанту добавляли 0.1 мл хлороформа, после чего энергично перемешивали смесь на вортексе и оставляли на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивалось на две фазы. По истечении 20 минут центрифугировали пробирку 5 минут при 12 тыс. об/мин. Образовывалось 2 слоя жидкости. Верхний слой переносили в чистую пробирку, т.к. в нем содержалась РНК. К отобранному верхнему слою добавляли равный объем депротеинизирующего фенолсодержащего раствора GгееnСlеап и энергично встряхивали смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин.

После центрифугирования снова переносили верхний слой жидкости, содержащей РНК в чистую пробирку, замеряя её объем. Добавляли двойной объем 96%-ного этанола и хорошо перемешивали содержимое пробирки. После чего пробирка помещалась в штатив на 20-30 минут при температуре -200С для формирования осадка РНК. РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин, после чего отбирался спиртовой супернатант и осторожно, по стенке пробирки, к осадку РНК добавляли 0,5мл 80%-ного этанола. Снова РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин. Спиртовой супернатант максимально удалялся из пробирки

Все дальнейшие процедуры проводились при температуре +40С. Растворяли осадок РНК в воде, затем отбирали аликвоту и определяли концентрацию РНК спектрофотометрически. Оценивали нативность РНК электрофорезом в 1.2-1.5%-ной агарозе, приготовленной на х1-ном ТВЕ и содержащей 0.3 мкг/мл бромистого этидия.

Препарат РНК можно хранить замороженным в воде при температуре –200С или ниже. Предпочтительно хранение в виде спиртового осадка при температуре –200С

2.4. Методика пцр Проведение процедуры обратной транскрипции

На этом этапе в результате проведения процедуры обратной транскрипции мы получали полноразмерную первую цепь комплиментарной ДНК (кДНК) из выделенной ранее матрицы мРНК.

В качестве праймера были выбраны случайные гексонуклеотиды. Они неспецифически связываются на мРНК, нарабатывая короткие кДНК практически по всей матрице мРНК. Такие праймеры подходят для изучения всей последовательности мРНК, особенно 5` район.

Реактивы:

1. M-MLV обратная транскриптаза

2. х10-кратный ОТ буфер для фермента

3. 2,5 mM смесь dNTP

4. Гексапраймеры

5. Вода, свободная от Рназ

Ход работы:

Все манипуляции проводятся на льду, т.е. при температуре +40С.

В пробирке смешали 5 мкл полученной ранее мРНК, 1мкл случайного гексапраймера и довели объем смеси до 18 мкл водой, свободной от РНаз. Перемешивали и осаждали капли кратковременным центрифугированием.

Смесь инкубировалась 5 минут при +700С, после чего пробирка переносилась в лед. Капли собирались кратковременным центрифугированием.

На льду в пробирку добавляли следующие компоненты: 0,5мкл M-MLV обратной транскриптазы, 2,5мкл х10-кратного ОТ буфера для фермента, 4мкл 2,5mM смесь dNTP. После чего смесь инкубировалась сначала 10 минут при температуре +250С, затем в течении 1 часа при температуре +370С. Реакция останавливалась путем нагревания смеси до +700С на протяжении 10 минут, после чего смесь переносили в лед.

Синтезированная кДНК может быть сразу использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Кроме того, полученный материал можно хранить при температуре –200С и ниже. Мы проводили ПЦР в день выделения РНК и синтеза кДНК, для того чтобы максимально сохранить полученный материал.

studfiles.net

Учёные из МГУ разработали новый метод выделения РНК из вирусов, бактерий, растений и животных

Главной задачей при выделении РНК всегда было избавление ее от белка. Этот процесс называется депротеинизация. Для выделения РНК из вирусов, бактерий и высших организмов применяют вещества, вызывающие разрушение сложных клеточных и вирусных комплексов, в которых находится РНК. Для этой цели наиболее частым было использование поверхностно активных веществ и фенола. Их сочетание позволяет выделить РНК практически из всех вирусов и клеток живых организмов. Нуклеиновые кислоты при этом переходят в водный раствор, а с каждой экстракцией 80% белка экстрагируется  в фенол.

В конце 80-х гг. Петр Хомчински и Николет Сакхи для выделения суммарной РНК (клеточной и вирусной) предложили эффективную одноступенчатую обработку клеток раствором смеси гуанидинтиоцианата, вызывающего распад комплексов РНК с белками, и фенола с хлороформом (фирменное название смеси — TRIzol). Используемые в методе реагенты — гуанидинтиоцианат, фенол и хлороформ — очень токсичны.

В связи со стремительным развитием биотехнологий выделение РНК приобретает массовый характер. На первый план выходит экологичность методов выделения РНК.

Доктор химических наук, заведующий лабораторией нуклеиново-белковых взаимодействий НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ Юрий Дрыгин предложил использовать для выделения РНК трихлорацетат аммония (ТХАА). Препараты РНК, полученные из вирусов, E.coli, растений и клеток животных с помощью ТХАА, по физико-химическим свойствам не отличаются от препаратов, выделенных известными раньше методами. Трихлорацетат аммония (ТХАА) не входит в Международный список токсичных веществ, он безвреден для растений, не влияет на клетки животных и человека in vitro и in vivo. Это обстоятельство особенно важно для массового выделения РНК, необходимого, например, для диагностики вирусных инфекций в чрезвычайных обстоятельствах: при массовых заражения растений, животных и людей (эпифитотиях, эпизоотиях и пандемиях).

В совместной публикации и заявке на грант РФФИ учёные из НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ с коллегами из Института технологий биоресурсов в Гималаях (CSIR — Institute of Himalayan Bioresource Technology) на основе разработанного способа развиваются методы выделения и детекции РНК с целью обнаружения вирусов и вироидов многолетних плодовых растений.

Статья была опубликована в журнале European Journal of Biotechnology and Science. 

www.msu.ru

Новый метод выделения РНК для обнаружения вирусов

Простой и экологичный метод поможет в диагностике массовых заболеваний растений и животных.

Группа ученых из НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и Института технологий биоресурсов в Гималаях разработала простой и экологичный метод выделения РНК из клеток бактерий, растений и животных. Метод поможет обнаруживать вирусы и послужит основой для развития диагностики массовых заболеваний растений и животных. Работа опубликована в журнале European Journal of Biotechnology and Science.

Для избавления от белка при выделении ДНК обычно используют поверхностно активные вещества и фенол. Их сочетание позволяет выделить РНК практически из всех вирусов и клеток живых организмов. Нуклеиновые кислоты при этом переходят в водный раствор, а с каждой экстракцией 80% белка экстрагируется в фенол. Используемые реагенты, соответственно, очень токсичны.

Ведущий автор исследования, Юрий Дрыгин из МГУ, предложил использовать для выделения РНК трихлорацетат аммония (ТХАА). Препараты РНК, полученные из вирусов, E.coli, растений и клеток животных с помощью ТХАА, по физико-химическим свойствам не отличаются от препаратов, выделенных известными раньше методами. При этом вещество не входит в Международный список токсичных веществ, безвредно для растений, не влияет на клетки животных и человека in vitro и in vivo.

Такой нетоксичный способ особенно важен для массового выделения РНК, необходимого, например, для диагностики вирусных инфекций в чрезвычайных обстоятельствах: при массовых заражения растений, животных и людей. «Число ученых растет, и выделение РНК приобретает массовый, промышленный характер. В связи с этим на первый план выходит экологичность выбираемого метода», — сказал Юрий Дрыгин.

[Публикация подготовлена Центром популяризации научных знаний МГУ им. М.В. Ломоносова]

scientificrussia.ru

Тотальная выделение - Справочник химика 21

    При тотальном выделении препаратов НК описанным выше способом полнота извлечения достигает 90—98%. [c.58]

    При острых отравлениях сулемою наблюдается тотальный некроз эпителия извитых канальцев почек, сопровождающийся его распадом и слущиванием. Внешний вид мочи меняется, она, как правило, окрашивается кровью, содержание белка в моче увеличивается, что является признаком отравления сулемою. Обычно на второй день после отравления выделение мочи прекращается, но спустя несколько дней анурия сменяется олигурией. В тяжелых случаях отравления патологические изменения в почках быстро развиваются и через 5— 6 дней в результате острой почечной недостаточности наступает смерть. [c.253]

    Выделение больших количеств тотальной ДНК из све [c.4]

    Выделение тотальной РНК из растений...... [c.4]

    Фенольный метод выделения тотальной РНК из растений [c.4]

    Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12 представлены результаты расщепления суммарной ДНК, агробактерий ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой кислоты агробактерий. [c.76]

    Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов некоторых видов растений. В отдельных экспериментах по трансформации может понадобиться анализ геномной ДНК (как ядерной, так и ДНК органелл) для выявления перенесенных последовательностей. В данной главе описаны методы выделения как небольших количеств нуклеиновых кислот, так и процедуры их крупномасштабного выделения. Эти методики нашли широкое применение для получения тотальной клеточной ДНК, а также ДНК из ядер и органелл. [c.238]

    Выделение тотальной ДНК яз лиофилизированных тканей растений [c.239]

    Метод выделения тотальной РНК из растений при помощи хлористого лития [c.269]

    Контрольные нетрансформированные растения табака SRI. Тотальный белок, выделенный из растений каждого типа и [c.343]

    Для подавления активности нуклеаз применяют различные ингибиторы цитрат натрия, гепарин, поливинилсульфат натрия, натриевые соли фтора, ДДС, суспензию бентонита, ионы серебра, цинка и др. Среди этих ингибиторов наиболее широким спектром действия обладают ДДС, поливинилсульфат натрия и суспензия бентонита. При тотальном выделении препаратов НК применимы все три указанных ингибитора. [c.73]

    Начало четвертого периода нефтепереработки хронологически совпадает с серединой нашего столетия. Его можно было бы характеризовать как период полной химизации всей технологии переработки нефти, за исключением процесса первичной ее перегонки. Эта всеобщая, тотальная химизация нефтепереработки и увеличение удельного веса каталитических процессов направлены на решение широкого комплекса технических, технологических и технико-экономических вопросов повышение степени использования сырья, увеличение ассортимента товарных нефтепродуктов, повышение их качества, повышение выходов наиболее ценных нефтепродуктов, в том числе моторных топлив, смазочных масел, исходных и промежуточных продуктов для химической промышленности. Широкое внедрение получают водородные каталитические процессы гидрирование, гидрокрекинг, гидродесульфирование и др. Для повышения технических свойств масел налаживается производство так называемых присадок, т. е. добавок, улучшающих эксплуатационные свойства нефтяных масел, а также производство синтетических масел. Крупнозаводское оформление получают процессы производства и разделения ароматических углеводородов, а также выделения из нефтепродуктов неразветвлен-ных парафинов и их тонкая химическая очистка с целью подготовки высококачественного исходного материала для промышленности микробиологического синтеза. [c.10]

    Полисахариды и вакцина брюшного тифа (10 убитых микробных тел на мышь), введенные подкожно за 24 ч до общего гамма-обдучения мышей в дозах 9,5—10,5 Гр, предотвращали гибель в среднем 10—30% животных. Весьма эффективной была комбинация полисахаридов или вакцины с цистеамином, которая вводилась за 5 мин до облучения. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин или хлор-тетрациклин), введенные мышам за 24 ч до облучения, не проявляли никакого защитного действия [Семенов и соавт., 1968]. В более ранних опытах Рогозкина (1960) у летально облученных мышей наблюдался значительный радиозащитный эффект ауреомицина, вводимого в течение 3—5 сут или однократно перорально в дозе 100—200 мг/кг за 2—3 ч до облучения в дозе 6 Тр. Точно так же стрептомицин, ауреомицин или биомицин, вводимые отдельно в течение 3—5 сут, давали защитный эффект при тотальном облучении крыс в дозе 7,5 Гр. Однократное пероральное введение ауреомицина или биомицина (200—300 мг/кг) за 30 мин до тотального облучения крыс в дозе 7,5 Гр не обнаружило какого-либо защитного действия. Повторные пероральные введения ауреомицина или биомицина с эк-молином в течение 3 сут или их однократный прием за 2—3 ч до тотального гамма-облучения в дозе 4 Гр повышали выживаемость облученных собак на 37,5 и 35,7% при 100% гибели незащищенных животных [Рогозкин, 1960]. Защитное действие было обнаружено у полисахарида зимозана, выделенного из дрожжевых клеток [Чертков и соавт., 1973]. [c.35]

    Суммарная или тотальная РНК в растительной клетке представлена тремя хорошо изученными типами молекул т-РНКг р-РНК и м-РНК. Для выделения РНК из растений в недеградированном состоянии обычно применяют различные модификации фенольно-детергентного метода. При выделении суммарной РНК 1ИЗ растений необходимо обрашать внимание на ингибицию активности РНК-азы, особенно следов ее, а также на очистку гомогената от полисахаридов и полифосфатов. [c.62]

    Однако при последовательном выделении НК растворами возрастающей экстрагирующей способности ДДС неприменим, так как он обладает депротеинизирующим действием, что ведет к тотальной экстракции НК- [c.73]

    Нанесение НК на колонку. Для разделения НК на обычную колонку наносят 3 мг тотального препарата. Если делят р-РНК, то на такую колонку наносят 5 мг, для анализа т-РНК и ДНК — 2 мг. Указанные количества НК растворяют в нескольких миллилитрах забуференной воды и объем доводят до 50 мл стартовым раствором. Может быть взят отдиализован-ный раствор НК после их препаративного выделения. Стартовыми растворами в зависимости от материала и целей эксперимента могут быть 0,1—0,4 М Na l pH 6,8. [c.83]

    Для более глубокого исследования характера воздействия ионола на биосинтез РНК нами было проведено хроматографическое разделение препаратов тотальной РНК, выделенных из асцитных клеток животных, на колонках с метилированным альбуМином, адсорбированным на кизельгуре (МАК) в градиенте Na l [14], Выделение РНК из асцитных клеток проводили по методике Шеррера и Дарнеллга с пятикратной депротеинизацией без поли- [c.345]

    Выделение ауксотрофных мутантов осуществляли тотальным отсевом выросших после обработки колоний на чашки с минимальной средой (МС), последующим отсевом невыросших на МС изолятов на сусло-агар и повторной проверке их на МС. Изоля-ты, показавшие обильный рост и спороношение только на сусло-агаре, были отобраны. Потребности ауксотрофных мутантов в факторах роста определяли по схеме Холидея [4]. [c.44]

    В качестве мутагена выбрали НММ как один из наиболее эффективных мутагенов, известных в настоящее время [2]. Исходным материалом для получения мутантов служил штамм ХЛ1-3, раса 1, ранее использовавшийся для получения морфологических мутантов под действием гамма-излучения [3]. Суспензию спор двухнедельной культуры гриба (1X10 спор/мл) в фосфатном буфере (pH 5,5) обрабатывали НММ (8ным = 0,04 М) при температуре 25° время обработки от 15 мин. до 4 час. Нри рассеве спор действие мутагена снимали разведением. Обработанные мутагеном споры для учета летального действия НММ и выделения морфологических мутантов высевали на среду Чапека. Выделение ауксотрофных мутантов осуществляли методом отпечатков и методом тотального пересева. Минимальной средой (МС) для выделения ауксотрофов служила среда Чапека, полной (ПС) — среда Чапека, обогащенная кукурузным экстрактом (20 г/л). Через 3—4 дня с колоний, выросших на ПС (при отсутствии ро- [c.334]

    С обнаружением отдельных генов или специфических геномных последовательностей связаны прежде всего возможности анализа микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных его членов в чистых культурах. Методы основаны на экстракции из почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее очистки и анализа с помощью градиентных гель-элект-рофорезов — термического и денатурирующего (ТООЕ/ООСЕ). Основной трудностью при экстракции тотальной ДНК является ее отделение и очистка от гуминовых веществ почвы. Однако методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются. [c.256]

    Еще более важным обстоятельством представляется то, что неопластическая трансформация происходит и при трансфекции клеток линии NIh4T3 с помощью ДНК из нормальных клеток. Причиной этого явления может быть аномальная экспрессия нормальных генов. Трансформирующая способность ДНК из нормальных клеток может быть показана в экспериментах двух типов. Во-первых, при использовании для трансформации последовательностей ДНК из нормальных клеток, гомологичных вирусным онкогенам ras и mos, которые способны индуцировать неопластическую трансформацию. Во-вторых, при трансфекции тотальной геномной ДНК, выделенной из различных нормальных клеток животных. [c.325]

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

    Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из А. tumefa iens [c.76]

    Кроме того, микрометоды (разд. 4.2.3.1 и 4.3.3.2) выделения, тотальной ДНК из трансформированных клеток растений позволяют получить предварительные данные о ее организации. Для таких методов требуется всего лишь 20 мг лиофилизиро-ванной либо 0,5 г свежей растительной ткани, а очистка в градиенте плотности СзС1/БЭ не применяется. Выделенная ДНК имеет достаточно большую мол. массу, однако сильно загрязнена РНК и в меньшей степени полисахаридами. Концентрацию нуклеиновой кислоты в таких неочищенных препаратах невозможно определить спектрофотометрически, однако содержание ДНК может быть определено достаточно точно очень чувствительным методом с использованием дифениламина (разд. 4.6). [c.238]

    Для многих типов клеток методы выделения эукариотической мРНК сходны [2, 14]. Ниже приведены две методики выделения тотальной РНК. из растений. В большинстве из них объем буфера для гомогенизации и масса клеточного материала рассчитаны для листьев широколиственных растений, каллусов либо клеток суспензионной культуры. Методика, предусматривающая использование фенола (разд. 4.7.3.1), подходит для выделения РНК из листовых пластинок и культивируемых клеток более чем 20 видов растений. При необходимости можно оптимизировать методики для других типов растительного материала, например листьев злаков, плодов и т. д., чтобы обеспечить эффективную экстракцию РНК и соответствующую обработку экстракта. [c.265]

    Качество электрофореза проверяют с помощью хемископа ), а затем гель фотографируют камерой Поляроид , снабженной красно-оранжевым фильтром. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага 1, рестрици-рованная HitidWl) должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо подобрав соответствующую концентрацию агарозы ") ). Препараты плазмидной ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд. 5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения (дорожка 4) [c.283]

    В клетках растений, выращенных на свету, в наибольшей концентрации выявляется мРНК гена СаЬ. В данном эксперименте на фильтр в виде точек наносят тотальную РНК лишь в двух концентрациях (0,1 и 1 мкг). Сравнивают относительное содержание транскриптов гена ab в недеградированных препаратах тотальной РНК, выделенной из облученных проростков. Чувствительность метода в случае молекул, выявляемых в меньшей концентрации, может быть значительно повышена благодаря использованию poly (А)+-мРНК. В меньшей степени чувствительность повышается при увеличении количества наносимой тотальной РНК, вплоть до 5 мкг на точку. [c.329]

chem21.info

Выделение РНК без ядовитых реактивов

Учёные из МГУ разработали новый метод выделения РНК из вирусов, бактерий, растений и животных

Пресс-служба МГУ

Главной задачей при выделении РНК всегда было избавление ее от белка. Этот процесс называется депротеинизация. Для выделения РНК из вирусов, бактерий и высших организмов применяют вещества, вызывающие разрушение сложных клеточных и вирусных комплексов, в которых находится РНК. Для этой цели наиболее частым было использование поверхностно активных веществ и фенола. Их сочетание позволяет выделить РНК практически из всех вирусов и клеток живых организмов. Нуклеиновые кислоты при этом переходят в водный раствор, а с каждой экстракцией 80% белка экстрагируется  в фенол.

В конце 80-х гг. Петр Хомчински и Николет Сакхи для выделения суммарной РНК (клеточной и вирусной) предложили эффективную одноступенчатую обработку клеток раствором смеси гуанидинтиоцианата, вызывающего распад комплексов РНК с белками, и фенола с хлороформом (фирменное название смеси – TRIzol). Используемые в методе реагенты – гуанидинтиоцианат, фенол и хлороформ – очень токсичны.

В связи со стремительным развитием биотехнологий выделение РНК приобретает массовый характер. На первый план выходит экологичность методов выделения РНК.

Доктор химических наук, заведующий лабораторией нуклеиново-белковых взаимодействий НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ Юрий Дрыгин предложил использовать для выделения РНК трихлорацетат аммония (ТХАА).

Препараты РНК, полученные из вирусов, E.coli, растений и клеток животных с помощью ТХАА, по физико-химическим свойствам не отличаются от препаратов, выделенных известными раньше методами. Трихлорацетат аммония (ТХАА) не входит в Международный список токсичных веществ, он безвреден для растений, не влияет на клетки животных и человека in vitro и in vivo. Это обстоятельство особенно важно для массового выделения РНК, необходимого, например, для диагностики вирусных инфекций в чрезвычайных обстоятельствах: при массовых заражения растений, животных и людей (эпифитотиях, эпизоотиях и пандемиях).

РНК-полимераза вируса. Источник: InfoCan

В совместной публикации и заявке на грант РФФИ учёные из НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ с коллегами из Института технологий биоресурсов в Гималаях (CSIR – Institute of Himalayan Bioresource Technology) на основе разработанного способа развиваются методы выделения и детекции РНК с целью обнаружения вирусов и вироидов многолетних плодовых растений.

Статья Kondakova et al. RNA isolation with low toxic ammonium trichloroacetate была опубликована в European Journal of Biotechnology and Science.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru  11.05.2016

www.vechnayamolodost.ru

• 
  Условия содержания растения спатифиллум
• 
  Мак растение как выглядит
• 
  Как выглядит донник растение
• 
  Комнатные растения уход бромелиевые
• 
  Размножение комнатное растение замиокулькас
• 
  Обработка хвойных растений осенью
• 
  Откуда появилось растение борщевик
• 
  Горшечные или горшочные растения
• 
  Интродукция растений рабочая программа
• 
  Ярмарка растений в воронеже
• 
  Что такое черевишня растения