Вирусология. Методические материалы. Вирусология растений
Вирусология. Методические материалы
СОДЕРЖАНИЕ ДИСЦИПЛИНЫ Раздел 1. Вирусология как наука. История развития вирусологии. Природа и происхождение вирусов. ВИРУСОЛОГИЯ КАК НАУКА Вирусология – наука, изучающая природу и происхождение вирусов, особенности их химического состава, генетики, строения, морфологии, механизмов размножения и взаимодействия с клеточными организмами. Вирусология занимает важное место среди биологических наук. Велико ее теоретическое и практическое значение для медицины, ветеринарии и сельского хозяйства. Вирусные болезни широко распространены у человека, животных и растений; кроме того, вирусы служат моделями, на которых изучаются основные проблемы генетики и молекулярной биологии. Изучение вирусов привело к пониманию тонкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению механизмов мутации. Современная вирусология включает следующие разделы: -общая вирусология, изучающая основные принципы строения и размножения вирусов, их взаимодействие с клеткой-хозяином,происхождение и распространение вирусов в природе.
-частная (медицинская, ветеринарная и сельскохозяйственная) вирусология изучает особенности различных систематических групп вирусов человека, животных и растений и разрабатывает методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых этими вирусами болезней. -молекулярная вирусология исследует молекулярно-генетическуюструктуру вирусов, строение и функции вирусных нуклеиновых кислот, механизмы экспрессии вирусных генов, процессы взаимодействия с клеткой, природу устойчивости организмов к вирусным заболеваниям, молекулярную эволюцию вирусов. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ВИРУСОЛОГИИ Первые упоминания о вирусных болезнях людей и животных встречаются в дошедших до нас письменных источниках древних народов. В них, в частности, содержатся сведения об эпизоотиях бешенства у волков, шакалов и собак и полиомиелите в Древнем Египте (II–IIIтыс. лет до н. э.). О натуральной оспе было известно в Китае за тысячу лет до нашей эры. Давнюю историю имеет также желтая лихорадка, на протяжении столетий косившая первопроходцев в тропической Африке и моряков. Первые описания вирусных болезней растений относятся к живописной пестролепестности тюльпанов, которые уже около 500 лет выращивают голландские цветоводы.
studfiles.net вирусология в вопросах и ответах
ИП имеет ряд преимуществ: 1.Принцип действия ИП основан на специфическом изменении организма животного в сторону максимального снижения возможности для возбудителя вызвать инфекционное заболевание. 2.ИП действует непрерывно и долго, иногда всю жизнь. 3.ИП не только изменяет реактивность организма животного, но и повышает способность к иммунной защите у всего поголовья. 4.Действие ИП на эпизоотический процесс может быть точно рассчитано. 5.При соответствующем выборе моментов прививки ИП обеспечивают максимальную защиту в самые опасные для заражения периоды жизни. 6.ИП можно увязать с технологическим процессом в животноводстве. 7.Используемые для ИП препараты можно дозировать, применять в разных сочетаниях и стандартизировать. 8.В отличие от АБ и химических препаратов ИП не вызывает явления резистентности у МО. 9.ИП требует меньших экономических затрат, затрат сырья.
10. ИП не оказывает никакого влияния на качество продукции животных. Отрицательные стороны: 1.Пероценка возможностей ИП. Владелец животного часто убежден, сто с проведением вакцинации уже все сделано для защиты, что приводит к ослаблению санитарно-гигиенических мер. 2.Слишком большое возрастание конечной стоимости продукции. 3.После прививочные реакции, которые в течение определенного времени снижает продуктивность, если используется недостаточно отработанная вакцина. 4.Слишком частое беспокойство животных, ведущее к снижению продуктивности. 5.Возникновение диагностических проблем и возрастание трудности в борьбе с заболеваниями, если вакцинные и патогенные штаммы в обычных условиях не различаются или различаются с большим трудом. Нецелесообразное применение вакцин может принести вред, поэтому для каждой конкретной инфекционной болезни и эпизоотической ситуации надо продуманно выбрать вакцину и вариант ее применения с учетом экономических затрат и эффективности, чтобы обеспечить наивысший результат массовых прививок. Иммунопрофилактика сложилась на основе давнего опыта человечества, согласно которому люди, перенесшие инфекционные заболевания вторично ими не заболевали. Раньше, когда в Афинах была чума человека. Фукидид сообщал, что больные оставались без помощи если бы за ними не ухаживали выздоравливающие люди. В Китае в 16 веке при оспе человека был обычай: вдыхать через нос высушенные растертые оспенные корочки. Дженер изобрел вакцину от оспы. Пастер предложил способ вакцинации против бешенства.
Профилактика вирусных болезней строится на тех же принципах, что и профилактика других инфекционных болезней: 1.Проведение организационных мероприятий. 2.ИП 3.Химиопрофилактика. Специфическая профилактика вирусных болезней обеспечивается применением живых, инактивированных, поли- и моновалентных сывороток. Классификация и характеристика иммунопрепаратов: Биопрепараты – продукты биологического происхождения, используемые для активной и пассивной ИП. Препараты для пассивной ИП – для парентерального и перорального введения АТ или Ig. С целью проведения ИП применяют иммунные, гипериммунные сыворотки, реконвалесцентную и аллогенную сыворотки. Реконвалесцентная сыворотка – сыворотка доноров переболевших или инфицированных животных. Ее используют, когда нет более эффективных средств в дозе 1мл\кг массы тела.
Гипериммунные сыворотки – сыворотки доноров, которые получают в результате однократного введения по определенной схеме массированных доз АГ. Подбирают здорового донора, не болевшего ранее этим заболеванием. Его вакцинируют и через 2-3 недели начинают вводить по определенной схеме в нарастающих дозах, доводят до пика нарастания АТ. Пик определяют путем постановки серологической реакцией на титр АТ (сыворотку проверяют на стерильность, активность и безвредность. Доза 2 мл\кг (лечебная), 1-1,5 мл\кг (профилактика). Вводят дробно. Сначала вводят сенсибилизированную дозу, а через 2-3 часа – разрешающую дозу, чтобы избежать анафилактического шока. Гамма-глобулины получают из гипериммунных сывороток путем освобождения от балластных белков. Их вводят п\к или в\м в дозе 0,5-2 мл\кг. Сначала вводится сенсибилизация, затем разрешающая доза. Аллогенная сыворотка – сборная сыворотка, которую получают от разных животных в условиях одного хозяйства. Она содержит большой набор АТ и различных АГ. Препараты для активной иммунизации – вакцины. Существуют живые и инактивированные вакцины.
Вакцины также классифицируют по: 1) Исходному вируссодержащему материалу – тканевые, эмбрион-вирус вакцины, культуральные вирусовакцины; 2) по методу аттенуации – лапинизированные (против ящура, чумы КРС и другого, используют кроликов), капринизированные (через организм козы, против оспы овец пассажированием через несколько коз, против КРС), овинизированные (через овец – против чумы КРС, ящура). Методы введения вакцин: 1.Подкожно 2.Внутримышечно 3.Аэрозольное 4.Ректальный метод 5.Интраназально ВОПРОС №42 «ИНАКТИВИРОВАННЫЕ ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ, ОТЛИЧИЕ ОТ ЖИВЫХ ВАКЦИН». Инактивированные вакцины – сложные по составу препараты. Производство их требует большого количества вируса. Основное требование, предъявляемое к убитым вакцинам, - полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности АГ детерминанты и иммунная защита привитых животных. Для получения инактивированных вакцин в качестве инактивантов широко используются формалин, хлороформ, тиомерсал, гидроксиламин, этанол, бета-пропиолактон, этиленимин, УФ-, гамма-облучение, температура. Инактивированные вакцины применяются только парентерально. В состав их обязательно входят адъюванты – неспецифические стимуляторы иммуногенеза. Требуется большая дозировка и, как правило, повторное введение. Они создают менее напряженный, непродолжительный иммунитет, чем при употреблении живых вакцин.
ВОПРОС №43 «ФАКТОРЫ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА». Специфические 1)Связан с качественносвоеобразными защитными механизмами, т.к. вирусы не способны развиваться вне живой клетки 2)Защита направлена на 2 формы сущ. вируса: вне и внутриклеточную. На покоящиеся форму действуют специфические и неспецифические факторы, гуморальные и клеточные факторы защиты. Вегетативные формы – интерферон, который препятствует синтезу иРНК вируса. 3)Вирус нейтрализующее АТ не реагирует с вирусными информационными НК. 4)Методы и средства нейтрализации вируса эффективны только на определенном этапе. 5)Особые факторы защиты: образуются внеклеточные оксифильные и базофильные гранулы и наличие противовирусных ингибиторов. 6)Данный иммунитет длительный, а иногда пожизненный. Неспецифические клеточные и общефизиологические реакции. -Температура -Гормоны – снижают резистентность, однако соматотропные гормоны повышают резистентность и усиливают воспалительную реакцию.
-Беременное животное заболевает быстрее и заболевание протекает более тяжело. -Физиологическое состояние выделительной системы – скорость выделения вируса из организма. -Гуморальные факторы – наличие сывороточных ингибиторов (термостабильных или термолабильных). У каждого вида преобладает свой тип. ВОПРОС №44 «ЖИВЫЕ ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ, ИХ СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ И ОТЛИЧИЯ ОТ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН». Живые противовирусные вакцины представляют собой лиофилизированные взвеси вакцинных штаммов вирусов, выращенных в различных биологических системах (КЭ, КК, в лабораторные животные) или используются природно-ослабленные штаммы возбудителя, которые создаются в процессе длительной эпизоотии. Основным свойством является стойкая утрата способности вызывать в организме привитого животного типичное инфекционное заболевание, также обладают способностью «приживаться» в организме животного, т.е размножатся. Пребывание и размножение вакцинного штамма продолжается обычно 5-10дн. до нескольких недель и не сопровождаются клиническими проявлениями, характерными для данной болезни, приводят к формированию иммунитета против инфекционного заболевания. Преимущества: высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета, приближающегося к постинфекционному. Возможность для большинства однократного введения. Введение не только подкожно, но и перорально и интерназально. Недостатки: чувствительность к неблагоприятным факторам. Строгие рамки хранения и транспортировки – температура – 4-8С. Недопустимо нарушение вакуума в ампулах с вакцинами. Строгие соблюдения правил асептики. Контроль качества: 1)всесторонние обследование доноров. 2)оценка качества питательной среды и КК на стерильность. 3)Надзор за качеством производственных штаммов вирусов. 4)Создание оптимальных условии для сохранения биоматериалов.
Инактивированные вакцины создают менее напряженный и продолжительный иммунитет, их надо вводить повторно. ВОПРОС №45 «БАКТЕРИОФАГИ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА». Бактериофаги (от. Лат. Bacteriophaga) – разрушающий бактерии. Это вирусы, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки репродуцироваться в них и вызывать их гибель. История открытия бактериофага связана с академиком Гамалеем, наблюдавшим случайный лизис сибиреязвенных бактерий.
Творт – описал перерождение стафиллококов (1915). Д’Эрель (1917) подробно изучил взаимодействие фага и бактерий дизентерийной палочки и дал агенту название «бактериофаг». В дальнейшем были выделены вирусы грибов, микоплазм и других МО. Поэтому для обозначения этих вирусов употребляется термин «фаг» - пожиратель. Структура и морфология фага. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты ДНК\РНК, окруженной капсидой, содержащей строго ориентированные капсомеры. Крупные фаги имеют головастикообразное строение, имеют головку, воротничок и хвостовой отросток, заканчивающийся 6-угольной базальной пластинкой к которой прикреплены фибриллы. Головка имеет 2 оболочки: наружную и такую внутреннюю мембраны, в которой заключена АК. Средний размер головки 60-100 нм, хвоста 100-200 нм. По морфологии фаги разделены на 6 групп: - фаги с длинным отростком, чехол которого сокращается – Т-четные фаги. - фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается. - фаги с аналогом отростка. - фаги с коротким отростком. - нитевидные фаги. - фаги без отростка. Химический состав фага.
Головка фага содержит одну из нуклеиновых кислот. В оболочке также содержатся липиды, углеводы. Фаги выдерживают давление до 6 тысяч атмосфер. Они устойчивы к действию окружающей среды, сохраняют свою активность в запасных ампулах до 13 лет. Быстро погибают при действии кипячения, УФЛ, определенных химических средств (1% фенол, спирт, эфир хлороформ не изменяют фага). Некоторые вещества: тимол, хлороформ, динитрофенол не оказывает влияние на фаги, но убивают бактерии. 1% раствор формалина инактивирует фаг. Различают фаги: полифаги (лизируют родственные бактерии), монофаги (лизируют родственные бактерии), монофаги (лизируют бактерии одного вида), фаги вызывающие лизис определенного серотипа 1 вида. По типоспецифическим свойствам фаги делят на серотипы. Специальные фаги можно легко адаптировать к родственным бактериям путем пассажирования на бактериях одного вида. Явление бактериофагии легко можно наблюдать как в жидких, так и в плотных питательных средах. Если в чашку с питательной средой засеять культуру и нанести несколько капель фага высокой концентрации, то на этом месте роста не будет – стерильные пятна. По механизму взаимодействия с клетками фаги подразделяются на вирулентные и умеренные.
Феномен бактериофагии, вызванный умеренными фагами проявляется только в виде фаз адсорбции, проникновения в клетки, репродукции и выделения фага. Весь процесс репродукции идет по типу ДНК-содержащих вирусов. Вирулентные фаги обеспечивают формирование новых фагов и лизис бактерий клетки. Установлено, что в инфицированных фагом бактериях в течение 1 минуты появляется 7-8 частиц фага. Схема репродукции. 1.Адсорбция фага на оболочке МО и растворение ее. Фаги адсорбируются своими жгутиками, эти жгутики прочно соединяются с рецепторами клеточной стенки, в результате чего происходит сокращение фаговой частицы и конец отростка вонзается в оболочку бактериальной клетки и одновременной фаг выделяет лизоцимоподобный фермент, который растворяет оболочку клетки. 2.Впрыскивание нуклеиновой кислоты внутрь микробной клетки. В микробную клетку впрыскивается вся нуклеиновая кислота и часть белков, чехлик остается на поверхности бактериальной клетки. 3.Латентная фаза – эклипс-фаза. Фаза способствует развитию ДНК вирусов. В начале синтезируется и-РНК, она дает начало синтезу ранних вирусных белков, которые прекращают клеточный метаболизм и дают начало формированию дочерних нуклеиновых кислот.
4.Образование новых фаговых частиц. Соединение двух основных фаговых частиц путем заполнения белковой оболочки фага нуклеиновыми фаговыми частицами. 5.Растворение оболочки бактериальной клетки и выход вновь образованных частиц за пределы клетки. Разрыву клеточной стенки способствуют: сильное увеличение внутриклеточного давления, а с другой стороны действие ферментативных процессов, вызываемых фагами. Количество воспринимаемых фагов различно и колеблется от 1 до 1000 и более. Весь процесс репродукции происходит от 3 до 10 часов. Лизогения – наряду с вирулентными фагами существуют и умеренные фаги, отличающиеся характером взаимодействия с бактериальной клеткой. Их основная особенность состоит в том, что они способны переходить из вегетативного состояния в неинфекционную форму, названную профагом, неспособную вызывать лизис бактерий. Бактериальные клетки содержащие профаг в хромосоме называются лизогенными, а явление – лизогения. При этом явлении зараженные фагом бактерии не лизируются. Но при искусственном лизисе могут высвободить фаг, способный инфицировать бактерии данного вида. Переход профага в вегетативный фаг происходит не часто. При заражении умеренными фагами 1 часть клеток лизируется с образованием вегетативного фага, а другая часть выживает и становиться лизогенной. В лизогенных бактериях ДНК фага интегрируется в ДНК клетки и умеренный фаг преобразуется в профаг, который не обладает литическим свойством. Лизогенные бакте6рии образующиеся в результате лизогенизации становятся носителями фага и на длительное время приобретают иммунитет. Эта связь прочная и нарушается при воздействии на бактерию индуцирующих агентов. Это УФ лучи, ионизирующая радиация, химические мутагены. Под влиянием указанных факторов профаг переводится в автономное состояние, происходит дезинтеграция. Лизогенизация бактерий сопровождается изменением их свойств (морфологических, культуральных и биологических свойств). Нетоксичные штаммы становятся токсигенными. Изменение свойств бактерий – фаговая конверсия. Лизогенные бактерии – наиболее удобные модели для изучения взаимодействия вирусов и клетки. В настоящее время умеренные фаги широко используются для изучения вопросов генетики, с помощью которой можно более точно дифференцировать процессы изменчивости. Под влиянием радиации увеличивается число фаговых частиц, продуцируемых клетками лизогенных бактерий. Практическое использование фагов – фаги используются для титрования бактерий, лечения и профилактики ряда инфекционных заболеваний, используются для определения дозы радиации на космических кораблях. ВОПРОС №46 «ЛАБОРАТОРЫНЕ ЖИВОТНЫЕ, ЦЕЛИ И МЕТОДЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ВИРУСОЛОГИИ». В связи с тем, что вирусы могут размножаться только в живых клетках, на самых ранних этапах развития вирусологии широко применяли культивирование вирусов в организме лабораторных животных, специально выращиваемых для проведения на них исследований. Используют: 1)для обнаружения вируса в ПМ 2)первичного выделения вируса из ПМ 3)накопления вирусной массы 4)поддержания вируса в лаборатории в активном сост. 5)титровании вируса 6)в качестве тест-объекта в РН 6)получение гипериммунных сывороток. Используемые животные: белые мыши (бешенство, ящур), белые крысы (грипп свиней, б. Ауески), морские свинки (бешенство, ящур, чума плотоядных). Кролики (бешенство, миксомы кроликов). Требования к лабораторным животным – животное должно быть чувствительным к данному вирусу; возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных; стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе. По чувствительности наибольшей стандартностью обладают так называемые линейные животные, полученные в результате близкородственного скрещивания в течении ряда поколений; лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат на карантине и ведут клиническое наблюдение. При наличии заболевания их уничтожают. Животных размещают так, чтобы с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Для животных разных видов применяют разные способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при непродолжительном сроке его можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах. Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдельных пальцев на передних или задних конечностях. Часто пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Заражение лабораторных животных. 1. подкожно – спина. 2. Внутрикожно – пятка 3. Внутримышечно – бедро 4. Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав) 5. Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание) 6. Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. Препарирование лаб. животных (на примере белой мыши) - Кожа смазывается дезинфектором. - Производится разрез по linea alba. - Вскрытие грудины – берутся легкие и помещаются в пробирку №1 - Вскрытие брюшной полости – берутся печень, селезенка, почка и помещаются в пробирку №2. - Производится вскрытие черепной коробки. Берется головной мозг, делаются срезы 4-х слоев, кусочки помещаются на фильтровальную бумагу и делаются отпечатки на стекло. ВОПРОС №47 «СТРОЕНИЕ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ КУРИНОГО ЭМБРИОНА. ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ, РЕШАЕМЫЕ МЕТОДОМ ЗАРАЖЕНИЯ КЭ И ЕГО ПРЕИМУЩЕСТВА ПЕРЕД КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ ВИРУСОВ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. Используют КЭ в вирусологии в основном для тех же целей, что и ЛЖ: обнаружения в патматериале активного вируса биопробой; первичного выделения вируса; поддержания вирусов в лаборатории; титрования вирусов; накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин; как тест-объект в реакции нейтрализации. Строение: 1.Скорлупа 2.Подскорлупная оболочка 3.Воздушная камера 4.Аллантоисная полость 5.Желточный мешок 6.Альбуминный мешок 7.ХАО – хорион-аллантоисная оболочка 8.Амниотическая полость 9.Эмбрион 10.Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной). С 5-12день КЭ могут использоваться для заражения 1) Скорлупа и подскорлупная оболочка служит хорошей защитой от факторов внешней среды. 2)КЭ содержат субстрат для выращивания вируса. 3)КЭ устойчивы к воздействиям связанных с выделением исследуемого материала. 4)КЭ легко доступны, экологичны, не требуют ухода, кормления, не образуют АТ. 6 методов заражения КЭ: 1)Заражение в аллантоисную полость (грипп, болезнь Ньюкасла). КЭ фиксируют вертикально тупым концом вверх, на стороне зародыша на 5-6мм выше границы воздушной камеры делают отверстие 1мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. 2)на ХАО (оспа, чума плотоядных): а)Ч/з естественную воздушную камеру. КЭ в штатив тупым концом вверх, в скорлупе против центра воздушной камеры окно 15-20мм. Снимают подскорлупную оболочку. На ХАО наносят 0,2 мм суспензии. Отверст. лейкопластырем. б)Ч/з искусственную воздушную камеру. Штатив горизонтально зародышем вверх. Делают 2 отверстия: над центром воздушной камеры, другое 0,2-0,5см сбоку, со стороны зародыша. Из первого зародыша отсасывают воздух, образуется искусственная воздушная камера, дном которого является ХАО, на него наносят инфекционную жидкость, заклеивают лейкопластырем. 3)В желточный мешок (хламидий, б. Марека): а)КЭ помещают в штатив вертикально. Отверстие над центром воздушной камеры, иглу на 3,5-4см под углом 45, противоположно месту нахождения зародыша. б)аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном штативе КЭ; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. 4)В амниотическую полость (грипп, болезнь Ньюкасла): закрыт способ – зародыш. вверх. Иглу вводят затупленным концом по направлению к зародышу откр. способ – над воздушной полостью отверстие 1,5-2,5см. Удаляют подскорлупную оболочку. Пинцет продавливают ХАО по направлению к зародышу. Затем амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну, водят туда суспензию. Отпускают. Лейкопластырь. 5)Заражение в тело зародыша. 6)в кровеносные сосуды. ВОПРОС №48 «ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЖДОГО ВИДА». Культура клеток (КК) – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика культивирования особенно успешно стала развиваться после 40-х годов. Этому способствовали следующие события: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение КК, открытие Хангом и Эндерсом способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток. Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных КК. Применяют следующие КК: 1) ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие invitroв один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. 2) Субкультуры – их часто используют и получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Они по чувствительности не уступают ПТКК, более экономичны. 3) Перевиваемые КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают их из первичных КК с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом , стабильны в условиях ростаinvitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. «+» перед первичными – проще готовить, заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Но они склонны к злокачественному перерождению. 4)Диплоидные КК – морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивированияinvitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 5)Суспензионные КК – перевиваемые культуры клеток в суспензии. ВОПРОС №49 « ПЕРВИЧНО-ТРИПСИНИЗИРОВАННЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК. ИХ ДОСТОИНСВА И НЕДОСТАТКИ. ПРИМЕНЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ». ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие invitroв один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации. studfiles.net 22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.
Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы. Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Источник получения клеток — ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека или почечных клеток обезьян. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной. Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей). Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено. Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов. 23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток. Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови. Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности. Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур[6][7]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. studfiles.net Общая вирусология
Общая вирусология 1. Значение открытия Д.И.Ивановского. Этапы развития вирусологии. Роль отечественных ученых в развитии вирусологии. Впервые существование вируса доказал в 1892 году Ивановский. В результате наблюдений он высказал предположение, что болезнь табака, под названием мозаичной, представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения: одно из них - рябуха, возбудителем которого является грибок, а другое неизвестного происхождения. Возбудитель мозаичной болезни табака не мог быть обнаружен в тканях больных растений с помощью микроскопа и не культивировался на искусственных питательных средах. Ивановский открыл вирусы - новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вируса, цитопаталогических вирусных инфекций, фильтрующихся форм микроорганизмов, хронического и латентного вирусоносительства. Этапы развития: Конец XIX — начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры, которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. Были открыты следующие вирусы: вирус табачной мозаики; ящура; желтой лихорадки; оспы и трахомы; полиомиелита; кори; вирус герпеса. 30-е годы — основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные. 1931 г. — в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза. Открыты: вирус гриппа; клещевого энцефалита. 40-е годы. Установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи. 50-е годы: Открыты вирусы: аденовирусы; краснухи; вирусы парагриппа. 70-е годы: открытие в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих вирусов. Открыты вирусы: вирус гепатита B; ротавирусы, вирус гепатита A. 80-е годы. Развитие представлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Компоненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Открыты вирусы: иммунодефицита человека; вирус гепатита C. 2. Понятие о вирусе и вирионе. Современные принципы классификации и номенклатуры вирусов. Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира. 1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие- от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм. 2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК. 3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению. 4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты. 5.У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок- синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. 6.Средой обитания вирусов являются живые клетки- бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека. Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной- вирион и внутриклеточной- вирус.Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов- конечной фазы развития вирусов. 3. Особенности структурной организации вирусов. Строение (морфология) вирусов. 1.Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК- вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК- вирусов). 2.Капсид - белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц- капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид- спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы). При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего- двадцатигранники - икосаэдры. 3.Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т.е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”. 4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина- суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”. Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов - плазмиды, вироиды и прионы. Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина. 1.Адсорбция- пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа- гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека- гликопротеин gp 120). 2.Проникновение- путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза). 3.Освобождение нуклеиновых кислот- “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты. 4.Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса. 5.Сборка вирионов- ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком. 6.Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами. 4. Морфология, химический состав и структура вирусов. Борисов Л.Б. – стр. 70 5. Классификация вирусов. Вирусоподобные структуры. Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства — р и б о в и р у с ы и д е з о к с и р и б о в и - р у с ы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов. В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно- микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, pH, детергентам и т.д. В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств (табл. 5.1). Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, ее структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы. 6. Репродукция вирусов. Ферменты вирусов. Этапы взаимодействия вируса с клеткой. Понятие о вирогении. Способы проникновения вируса в клетку. Борисов – стр. 74-75 7. Особенности репродукции ДНК и РНК содержащих вирусов. Особенности взаимодействия ретровирусов с клеткой. Борисов стр. 75. 8. Вирусоподобные структуры. Вироиды и прионы, их роль в патологии. Борисов – стр. 90 9. Методы культивирования вирусов. Индикация и идентификация вирусов. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах. Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови. Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности. Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз. Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек. Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами. К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов. Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки). Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования. 10. Методы диагностики вирусных инфекций. Лабораторная диагностика вирусных инфекций базируется на 3 группах методов: Вирусологический метод - выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация. Серологический метод - определение в сыворотке крови больных специфических противовирусных антител с помощью разнообразных иммунологических реакций. Генодиагностика - обнаружение в материале от больного специфичных для данного вируса фрагментов нуклеиновых кислот вирусов-возбудителей с помощью метода зондов (гибридизация НК) или ПЦР. Прямое вирусоскопическое исследование мазков из клинического материала, окрашенных анилиновыми красителями, с целью выявления вирусов в настоящее время в практике работы вирусологических лабораторий проводится редко. Чаще применяются с целью поиска антигенов вируса ИФМ или микроскопический вариант ИФА как экспресс-методы диагностики вирусных инфекций. Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики Вирусологическому исследованию подвергают содержимое везикул, пустул, соскобы эпителия, спинномозговую жидкость, фекалии, мазки и смывы из верхних дыхательных путей, взятые у больного с соблюдением правил асептики в ранние стадии вирусной инфекции. Мазки из носоглотки и кожные соскобы помещают в ИРХН или раствор Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (для подавления сопутствующей микрофлоры). Исследуемый материал хранят и пересылают в вирусологическую лабораторию в специальных контейнерах с сухим льдом. Пробы можно сохранять в условиях глубокой заморозки (-700 С). Вирусологический метод Поскольку вирусы относятся к облигатным внутриклеточным паразитам и на искусственных питательных средах не растут, для их культивирования применяются живые системы (культуры клеток, развивающиеся куриные эмбрионы, чувствительные лабораторные животные). Выделение вирусов на культурах клеток В практике вирусологических лабораторий для выделения вирусов используют первично-трипсинированные, полуперевиваемые (диплоидные) и перевиваемые клеточные культуры. Первично-трипсинированные культуры клеток можно получить из любых органов и тканей человека, животных, насекомых, растений, однако наиболее часто используются эмбриональные ткани (фибробласты куриного эмбриона, человека, и др.), обладающие повышенной способностью к росту и размножению. Для получения клеточной взвеси ткань отмывают от крови в растворе Хенкса, измельчают ножницами и несколько раз обрабатывают трипсином на магнитной мешалке или путем пипетирования. Затем взвесь клеток отмывают от трипсина раствором Хенкса путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде и определяют концентрацию клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь разводят питательной средой (обычно среда № 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) до концентрации 4-8х105 клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды, закрывают резиновыми пробками. Пробирки укладывают под углом 50. Культивирование клеток осуществляют в термостате при 35-370 С 48-96 часов, в течение которых формируется монослой клеток, прикрепляющийся к поверхности стекла (или пластика). С помощью версена (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты - ЭДТА) (реже трипсина), клетки можно снять с поверхности культуральной емкости и перенести их в другую емкость (произвести пассаж). Для этого в сосуды с клетками после отсасывания питательной среды наливают 0,02% раствор версена или 0,25% трипсина и помещают их на 3-5 мин в термостат. Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды, в которой суспендируют клетки, подсчитывают их количество, доводят их до требуемой концентрации и разливают в новые флаконы. Однако первично-трипсинизированные клеточные культуры не выдерживают более 5-10 пассажей. Перевиваемые клеточные культуры, в отличие от первично-трипсинированных, переносят неограниченное число пассажей, так как обычно их получают из опухолевых клеток, имеющих высокие способности к росту. Широкое распространение в вирусологии получили культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa), раковой опухоли гортани (НЕр-2), костного мозга больного раком легких (Detroit-б) и т.д. Созданы «банки» перевиваемых клеточных культур, в которых хранятся клетки, замороженные жидким азотом. Полуперевиваемые (диплоидные) культуры получают путем нескольких пассажей, в результате чего формируется популяция клеток, способных выдержать до 60 пассажей, быстро размножаться, быть высокочувствительными ко многим вирусам, сохраняя при этом исходный набор хромосом. Для культивирования клеток используются специальные стерильные питательные среды (например, среды 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др.) с рН 7,2-7,6, содержащие полный набор аминокислот, витамины, факторы роста и набор минеральных веществ, к которым добавляют от 2 до 30 % сыворотки крови животных (сыворотка крупного рогатого скота, эмбриональная телячья сыворотка и др.), а также антибиотики для предотвращения роста бактериальной флоры. Среды содержат индикатор феноловый красный, который имеет оранжево-желтый цвет при кислой реакции среды и красно-малиновый цвет в щелочной среде. Поддерживающие среды либо не содержат сыворотки, либо содержат ее в небольшом количестве. Их применяют для сохранения выросших клеток после заражения их вирусами. Для выделения вирусов питательную среду из пробирок с культурой клеток удаляют, промывают монослой клеток раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов, после чего в пробирку вносят 0,1-0,2 мл обработанного вируссодержащего материала. Через 30-60 мин после заражения материал из пробирки удаляют, вносят 1 мл поддерживающей среды и пробирки помещают в термостат при 370 С для культивирования. Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах Для культивирования вирусов используют 6-15-дневные куриные эмбрионы. Заражение осуществляют на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в желточный мешок, полость амниона и аллантоиса. При заражении на ХАО скорлупу обрабатывают спиртом, йодом и снова спиртом. Скорлупу прокалывают над воздушным мешком, а сбоку в скорлупе делают отверстие размером 7x2 мм. Не повреждая оболочку под скорлупой, короткой тонкой иглой шприца наносят на ХАО 0,1—0,2 мл вирусосодержащего материала. Заражение в полость аллантоиса осуществляют путем введения исследуемого материала шприцем на глубину 10—15 мм через боковое отверстие в скорлупе. В полость амниона вирусосодержащий материал вводят через отверстие на тупом конце яйца, при этом игла шприца должна быть направлена к телу эмбриона. Дефекты скорлупы заливают стерильным парафином и эмбрионы помещают в термостат. Выделение вирусов на экспериментальных животных. Экспериментальные животные в вирусологии применяются для диагностики вирусных инфекций, получения иммунных противовирусных сывороток и компонентов крови (эритроцитов, лейкоцитов, плазмы и т.д.), моделирования вирусных инфекций с научными целями для изучения патогенеза, иммунитета, патоморфологии и т.д., а также для разработки способов специфической и неспецифической профилактики и лечения вирусных инфекций. В вирусологии в качестве экспериментальных животных наиболее часто используются белые мыши, морские свинки, кролики, хомячки, хлопковые крысы, обезьяны. Чувствительной моделью при ряде вирусных инфекций являются новорожденные грызуны. Правила заражения и вскрытия экспериментальных животных при вирусных и бактериальных инфекциях идентичны. Экспресс-диагностика вирусных инфекций Экспресс-диагностика вирусных инфекций применяется для выявления вирусов или их антигенов в различных видах клинического материал с помощью методов, характеризующихся высокой специфичностью, чувствительностью, информативностью и быстротой исполнения. Реакция иммунофлюоресценции (прямой и непрямой методы РИФ) применяется для выявления вируса в материале, полученном от больных, в инфицированных культурах клеток и в организме чувствительных животных. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ) отличается возможностью одновременной концентрации вируса и его идентификации с помощью специфической противовирусной сыворотки. Для этого вируссодержащий материал обрабатывают противовирусной сывороткой, затем добавляют фосфорно-вольфрамовую кислоту или уранилацетат, смесь наносят на пленку (подложку) и высушивают. При электронной микроскопии при положительном результате находят скопления вирусных частиц. ИЭМ применяют для выявления в исследуемом материале полиовирусов, цитомегаловирусов, вирусов гепатита А и В, некультивируемых вирусов (аденовирусов в ткани миндалин, энтеро- и ротавирусов в фекалиях, вирусов оспы в оспенном детрите). Встречный иммуноэлектрофорез обычно применяется для обнаружения в сыворотках крови больных вирусных антигенов (например, HBsAg у больных гепатитом В). Реакцию ставят на стеклянных пластинах в слое агаре, в котором вырезают два параллельных ряда лунок. Сыворотки крови, содержащие антигены помещают в лунки, расположенные ближе к катоду, а соответствующие противовирусные сыворотки (антитела) - в лунки, находящиеся ближе к аноду, после чего проводят электрофорез, при котором HBsAg, с отрицательным зарядом передвигается к аноду, а антитела — к катоду. Учет реакции осуществляется через 12-24 часа, положительные результаты реакции характеризуются образованием линий преципитации между определяемым антигеном (HBsAg) и специфическим антителом. Реакция гемадсорбции на твердой основе (РгадТО). Лунки полистироловых планшетов обрабатывают иммуноглобулином или иммунной сывороткой (например, против ротавирусов), вносят в них исследуемый вируссодержащий материал, через 30-60 мин лунки промывают буферным раствором, после чего добавляют взвесь сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином эритроцитов и спустя 30-60 мин производят учет по наличию гемагглютинации. Если в исследуемом материале содержится специфический вирусный антиген, он соединяется с антителами иммуноглобулина (или сыворотки), адсорбированными на поверхности лунок, а затем с иммуноглобулинами на поверхности эритроцитов, в результате чего происходит гемагглютинация. В описанной модификации реакция применяется для выявления антигенов ротавирусов и других вирусов в фекалиях больных. 11. Особенности противовирусного иммунитета. Интерфероны. Возрастные особенности противовирусного иммунитета. Значение плацентарного иммунитета в защите новорожденного от некоторых вирусных инфекций (корь и др.) Интерфероны — гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Блокируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной системы. Различают две серологические группы интерферонов: I тип — ИФН-α и ИФН -β; II тип — ИФН-.γ Интерфероны I типа оказывают противовирусные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферон II типа регулирует специфический иммунный ответ и неспецифическую резистентность. α- интерферон (лейкоцитарный) продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами. β-интерферон (фибробластный) продуцируется фибробластами, обработанными вирусами. ИФН I типа, связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов. Антивирусное действие ИФН I типа может обуславливаться и тем, что он способен угнетать клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокислот. ИФН-γ продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов и нейтрофилов. Индуцирует апоптоз активированных макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов. Генно-инженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения лейкоцитарного интерферона включает следующие этапы: 1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплементарных ДНК с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии. Интерфероны применяются для профилактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется дозой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях заболевания, применяется местно. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных новообразованиях. 12. Особенности вирусных инфекций. Патогенность и вирулентность вирусов обычно называют инфекционностью. Эти свойства характеризуют генетически детерминированную способность вирусов к облигатному внутриклеточному паразитизму, способность к репродукции в чувствительных к ним клетках. Инфекционность вирусов связана с их нуклеиновой кислотой – ДНК или РНК. Вирусы, так же как и другие микроорганизмы, попадают в макроорганизм, а затем распространяются в нем лимфогенными и гематогенными путями. При этом вследствие облигатного внутриклеточного паразитизма вирусы обязательно должны проникнуть в клетку хозяина. В процессе репродукции вирусов в инфицированных клетках при многих вирусных заболеваниях (оспа, грипп, бешенство, корь, герпес и др.) появляются своеобразные структуры овальной, округлой, удлиненной или элипсоподобной формы, называемые внутриклеточными включениями. Их величина 1,2 – 25 мкм. Одни из них окрашиваются кислыми, другие – основными красителями, в связи с этим их делят на эозинофильные и базофильные. Внутриклеточные включения при бешенстве, гриппе, натуральной оспе образуются в цитоплазме пораженных клеток. При заражении вирусами герпеса, аденовирусами – в ядрах клеток. Эти образования носят строго специфический характер, поэтому их обнаружение имеет важное значение при диагностике вирусных инфекций. При исследовании включений при помощи электронного микроскопа и гистохимическими методами установлено, что включения представляют собой внутриклеточные скопления вирусов. Цитопатическое действие вирусов, крайне разнообразно. Вирусы после выздоровления макроорганизма могут быстро исчезать из него или сохраняться в нем в течение разных сроков, длящихся порой много лет. Наличие вируса в организме не всегда сопровождается его выделением. Вирусные инфекции протекают в виде продуктивной (острой) инфекции или в виде персистенции. Продуктивная, или острая, вирусная инфекция сопровождается репродукцией вирионов в клетках хозяина и сравнительно быстрым выделением возбудителя из организма. Персистенция характеризуется длительным присутствием вируса в организме человека или животного. Персистенция вирусной инфекции проявляется в латентной, хронической и медленной форме. Латентная бессимптомная инфекция характеризуется длительным, а в некоторых случаях пожизненным носительством вируса, который не покидает организм и не выделяется в окружающую среду. В одних случаях это связано с его дефектностью, в результате чего он не может репродуцироваться с образованием полноценного вируса. В других случаях это объясняется формированием состояния вирогении, характеризующимся встраиванием вирусной нуклеиновой кислоты в геном клетки и находящейся в репрессивном состоянии. В результате синхронной репликации с клеточной ДНК вирус передается новым клеткам. Иногда при инактивации репрессора происходит репродукция вируса, выход потомства из клетки и как результат наблюдается развитие острой (продуктивной) инфекции. Полагают, что латентная инфекция в форме вирогении формируется при герпесе. Спонтанная активация вирусной информации, содержащейся в геноме клетки, приводит к рецидивам заболевания на протяжении всей жизни человека. Вторая форма персистениции протекает в виде хронической инфекции, сопровождающейся периодами улучшения и обострения на протяжении многих месяцев и даже лет. При этом происходит периодическое выделение вируса из организма больного. Хроническую инфекцию могут вызывать аденовирусы, вирусы гепатита, герпеса. Третья форма персистенции – медленные инфекции. Для них характерен очень длинный инкубационный период, продолжительность которого исчисляется многими месяцами и даже годами. Происходит постепенное нарастание симптомов заболевания, заканчивающееся тяжелыми расстройствами или смертью больного. При многих медленных инфекциях вирусы выделяются из организма. Если вирус интегрирует в геном клетки, выделение его из организма прекращается. 13. Генетика вирусов. Генетические и негенетические взаимодействия у вирусов. Геном вирусов содержит или РНК, или ДНК (РНК- и ДНК- вирусы соответственно). Выделяют позитивную (+) РНК, обладающую матричной активностью и соответственно- инфекционными свойствами, и негативную ( - ) РНК, не проявляющую инфекционные свойства, которая для воспроизводства толжна транскрибироваться(превращаться) в +РНК. Механизмы репродукции различных вирусов очень сложные и существенно отличаются. Основные их схематические варианты представлены ниже. 1. вирионная (матричная) +РНК à комплементарная -РНК (в рибосомах) à вирионная +РНК. 2. - РНК à вирусная (информационная) +РНК à - РНК (формируется на геноме зараженной клетки). 3. однонитевая ДНК: +ДНК à +ДНК -ДНК à +ДНК -ДНК +ДНК à +ДНК. 4. ретровирусная однонитевая РНК: РНК à ДНК (провирус) à РНК. 5. двунитевая ДНК: разделение нитей ДНК и формирование на каждой комплементарной нити ДНК. Генофонд вирусов создается и пополняется из четырех основных источников: двух внутренних (мутации, рекомбинации) и двух внешних (включение в геном генетического материала клетки хозяина, поток генов из других вирусных популяций). Комплементация- функциональное взаимодействие двух дефектных вирусов, способствующее их репликации и горизонтальной передаче. Фенотипическое смешивание- при заражении клетки близкородственными вирусами с образованием вирионов с гибридными капсидами, кодируемыми геномами двух вирусов. Популяционная изменчивость вирусов связана с двумя разнонаправленными процессами - мутациями и селекцией, связанными с внешней средой как индуктором мутаций и фактором стабилизирующего отбора. Гетерогенность вирусных популяций- адаптационный генетический механизм, способствующий пластичности (устойчивости, приспособляемости) популяций, фактор эволюции и сохранения видов во внешней среде. Генофонд вирусных популяций сохраняется за счет нескольких механизмов: - восстановления изменчивости за счет мутаций; - резервирующих механизмов (возможность перехода любых, даже негативных мутаций в следующую генерацию)- комплементация, рекомбинация; - буферных механизмов (образование дефектных вирусных частиц, иммунных комплексов и др.), способствующие сохранению вируса в изменяющихся внешних условиях. dendrit.ru Статья - Вирусология 2 - Биология
Задание 1. Дать понятие и раскрыть историю науки Вирусология. Вирусология – быстро развивающаяся отрасль современной биологии. Её теоретическое и практическое значение для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства – огромно. Вирусология занимает важное место среди медико-биологических наук, так как вирусные болезни широко распространены у человека, животных и растений; кроме того, вирусы служат моделями, на которых изучаются основные проблемы генетики и молекулярной биологии. Изучение вирусов привело к пониманию тонкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению механизмов мутации. Вирус (лат.)- яд. Вирусология — наука о вирусах; субмикроскопических внутриклеточных паразитах. В середине XXв. вирусология выделилась в самостоятельную дисциплину. В результате наблюдений Д.И.Ивановский и В.В.Половцев впервые высказали предположение, что болезнь табака, так называемой табачной мозаики, представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения: одно из них — рябуха, возбудителем которого является грибок, а другое неизвестного происхождения. Д.И.Ивановский пришел к выводу, что мозаичная болезнь табака вызывается бактериями, проходящими через трубочки очень маленького диаметра (фильтры Шамберлана), которые не способны расти на искусственных субстратах. Возбудитель мозаичной болезни называется Ивановским то “фильтрующимися” бактериями, то микроорганизмами, так как сформулировать сразу существование особого мира вирусов было весьма трудно. Д.И.Ивановский открыл вирусы — новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вируса, цитопотологических вирусных инфекций, фильтрующихся форм микроорганизмов, хронического и латентного вирусоносительства. Строение и свойства вирусов Вирусы обитают только в клетках, это внутриклеточные паразиты. В свободном, активном состоянии они не встречаются и не способны размножаться вне клетки. Если у всех клеточных организмов обязательно имеются две нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК, то вирусы содержат только одну из них. На этом основании все вирусы делят на две группы: ДНК-содержащие и РНК-содержащие. ДНК находится в вирусах животного и человека. РНК находятся в вирусах растении. В отличие от клеточных организмов у вирусов отсутствует собственная система, синтезирующая белки. Вирусы вносят в клетку только свою генетическую информацию. Молекула ДНК вирусов, или их геном, может встраиваться в геном клетки хозяина и существовать в таком виде долгое время. Таким образом, паразитизм вирусов носит особый характер – это паразитизм на генетическом уровне. Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В среднем они в 50 раз меньше бактерий. Их нельзя увидеть в световой микроскоп, так как их длины меньше длины световой волны. Схематический разрез вируса дополнительная оболочка капсомер сердцевина Вирусы состоят из различных компонентов: а) сердцевина генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу. б) белковая оболочка, которую называют аспидом. Оболочка часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц — капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии. в) дополнительная липопротеидная оболочка. Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес). Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом. Положения о том, что вирусы представляют собой полноценные организмы, позволило окончательно объединить все три названных группы вирусов — вирусы животных, растений и бактерий — в одну категорию, занимающую определенное место среди живых существ, населяющих нашу планету. Тот факт, что их не удалось выращивать на искусственных питательных средах, вне клеток, не вызывал особого удивления, так как вирусы с самого начала были определены как строгие внутриклеточные паразиты. Это свойство признавалось не уникальным, присущим только вирусам, поскольку внутриклеточные паразиты известны и среди бактерий, и среди простейших. Как и другие организмы, вирусы способны к размножению. Вирусы обладают определенной наследственностью, воспроизводя себе подобных. Наследственные признаки вирусов можно учитывать по спектру поражаемых хозяев и симптомам вызываемых заболеваний, а также по специфичности иммунных реакций естественных хозяев или искусственных иммунизируемых экспериментальных животных. Сумма этих признаков позволяет четко определить наследственные свойства любого вируса, и даже больше — его разновидностей, имеющих четкие генетические маркеры, например: нейтропность некоторых вирусов гриппа, сниженную патогенность у вакциональных вирусов и т.п. Изменчивость является другой стороной наследственности, и в этом отношении вирусы подобны всем другим организмам, населяющим нашу планету. При этом у вирусов можно наблюдать как генетическую изменчивость, связанную с изменением наследственного вещества, так и фенотипическую изменчивость, связанную с проявлением одного и того же генотипа в разных условиях. Примером первого типа изменчивости являются мутанты одного и того же вируса, в частности температурочувствительные мутанты. Примером второго типа изменчивости служит разный тип поражений, вызываемых одним и тем же вирусом у различных животных, растений и бактерий. Все вирусы по своей природе — паразиты. Они способны воспроизводить себя, но только внутри живых клеток. Обычно вирусы вызывают явные признаки заболевания. Попав внутрь клетки, они “включают” ее ДНК и, используя свою собственную ДНК или РНК, дают клетке команду синтезировать компоненты вируса. Компоненты вируса способны к спонтанному образованию вириона. Клетка, израсходовав все жизнетворные соки на синтез вирусов, гибнет, перегруженная паразитами. Вирусы “разрывают” оболочку клетки и передаются в другую клетку в виде инертных частиц. Вирусы вне клетки представляют собой кристаллы, но при попадании в клетку “оживают”. Вирусы, как и другие организмы, характеризуются приспособляемостью к условиям внешней среды. Нужно только не забывать, что для них организм хозяина является средой обитания, поэтому многие условия внешней среды влияют на вирус опосредованно — через организм хозяина. Однако многие факторы внешней среды могут и непосредственно воздействовать на вирусы. Достаточно вспомнить уже названные температурочувствительные мутанты вирусов, которые, например, размножаются при температуре 32-37. С и гибнут при температуре 38-40. С, хотя их хозяева остаются вполне жизнеспособными при этих температурных режимах. В связи с тем, что вирусы являются паразитами, они подчиняются закономерностям и к ним применимы понятия экологии паразитизма. Каждый вирус имеет круг естественных хозяев, иногда очень широкий, как, например, у мелких РНК-геномных фагов: в первом случае поражаются все млекопитающие, во втором — отдельные клоны кишечной палочки. Циркуляция вирусов может быть горизонтальной (распространение среди популяции хозяев) и вертикальной (распространение то родителей потомству). Таким образом, каждый вирус занимает определенную экологическую нишу в биосфере. Задание 2. Охарактеризовать группу живых организмов и их роль в природе и для человека (привести примеры). Вирусы – внутриклеточные паразиты растений. Роль микроорганизмов в природе и хозяйственной деятельности человека. Био — повреждения косметических средств. Для изготовления косметических средств используют жиры, смолы, эфирные масла, спирты, витамины, гормоны, ферменты, глицерин, а также экстракты растений, которые являются хорошей питательной средой для микроорганизмов, поэтому 25% косметических средств содержат живые микроорганизмы. Во всех группах сырья встречают споровые, палочки, кокки-стафилококки, бактерии группы кишечной палочки. В результате размножения микроорганизмов в косметических средствах наблюдается изменение цвета и консистенции. Био-повреждения текстильных волокон. Хлопок состоит из целлюлозы — это волокна длиной до 40 мм, покрывающие семена, растения хлопчатника. Может подвергаться разложению со стороны пектиновых бактерии. Льняное волокно и шелк также подвергаются порче микроорганизмами. Целлюлозные бактерии разрушают все материалы содержащие клетчатку. При условиях повышенной влажности характерно плесневение. Гнилостные бактерии вызывают распад целлюлозы. Кожа и мех. Бактерии возникают в результате заболевания животных, загрязнении кожного покрова, неполноценного кормления животного. Оспины появляются после того, как животное переболело оспой. Порша — кожные покровы покрываются струпьями. Отслаивание – гнилостное разложение, которое возникает при разложении масляно-кислых бактерии. Вирусы играют большую роль в жизни человека. Они являются возбудителями ряда опасных заболеваний – оспы, гепатита, полиомиелита, энцефалита, краснухи, кори, гриппа и др. Микроорганизмы вызывают инфекционные заболевания, такие как ОРВИ и ОРЗ. Вирусы – внутриклеточные паразиты растений. О том, что растения болеют, люди узнали в те далекие времена, когда перешли на оседлое земледелие. Земледельцы как могли, лечили растения, старались предотвратить массовое поражение. Один из возбудителей болезней растений — вирус табачной мозаики. Подобный вирус встречается у картофеля, томатов, цветов, плодовых и ягодных культур. Одним из признаков вирусного поражения является изменение окраски цветов в поколения (например, тюльпанов) и изменения окраски листьев (желтуха растений). Семейство клостеровирусов объединяет около 20 нитевидных вирусов растений, переносимых тлями. Хотя клостеровирусы вызывают экономически важные заболевания культурных растений (например, желтуху сахарной свеклы и тристецу цитрусовых), их молекулярная биология начала изучаться недавно. Вирус желтухи свеклы (ВЖС) стал первым клостеровирусом, геном которого удалось секвенировать и проанализировать. Выяснилось, что в больших РНК геномах ВЖС и других представителей клостеровирусов закодированы белковые последовательности, гомологии которых отражают несколько уровней консервации. Во-первых, это домен РНК полимеразы, который универсален для всех РНК вирусов; во-вторых, белки, гены которых есть только у клостеровирусов; и, в-третьих, это белки, которые индивидуальны для каждого клостеровируса. Наиболее вероятным эволюционным сценарием наращивания больших РНК геномов следует признать дупликацию собственных последовательностей и захват чужих генов в результате РНК рекомбинации. В этой связи интересна судьба и функция 65К белка, ген которого мог быть захвачен геномом предка клостеровирусов из м-РНК клетки-хозяина. Безвирусные и вирусоустойчивые растения. Разработка эффективных противовирусных мероприятий основаны на характерной особенности каждого вируса растений, на передаче заболевания от одних растений другим. Применяется термическая обработка, химиотерапия, сочетание этих способов (опрыскивание растений или насыщения атмосферы термокамеры ингибиторами вируса). Используется также метод, названный культурой меристемы. Метод, основан на том, что в различных тканях растений вирусы распространены не равномерно, а некоторых частях отсутствует (например, в клетках меристемы, в точках роста). Данный участок в стерильных условиях вырезается и является материалом для получения здорового потомства. Задание 3. Рассмотреть охрану и основные экологические проблемы окружающей среды. Экономические мотивы рационального природопользования и охраны природы. На территории России расположено более 24 тыс. предприятии загрязняющих атмосферный воздух и водоемы. Тропические леса вырубаются со скоростью 26 га в минуту. Острейшей экологической проблемой России является деградация. Деградация земель в Тундре происходит в результате нарушения растительного покрова при освоении месторождении. Все более опасный характер приобретает захламление территории, загрязнение земель свалками в промышленных и бытовых отходах. В результате чернобыльской аварии загрязненными являются Брянская, Орловская, Тульская, Калужская, Рязанская области. Экологические проблемы Республики Башкортостан. РБ занимает 8 место по выбросам в атмосферу и 17 место по сбросам загрязняющих стоков. 1. Захламление территории отходами производства. 2. Продолжается химические загрязнения атмосферы, водоемов и почвы. Отмечается загрязнения грунтовых вод, в результате добычи и транспортировки нефти. 3. На всей территории РБ выпадают кислотные осадки. 4. Нарушение сельскохозяйственных земель. 60% пахотного фонда РБ страдает от эрозии, снижается биологическое разнообразие. Причины ухудшения экологической ситуации. 1. Высокая концентрация нефтеперерабатывающих и химических предприятии. 2. Применение устаревшего оборудования. 3. Частые аварии с экологическими последствиями Экономические мотивы рационального природопользования и охраны природы. Рациональное природопользование – хозяйственная деятельность человека, обеспечивающая экономное использование природных ресурсов и условий, их охрану и воспроизводство с учетом не только настоящих, но и будущих интересов общества. Охрана природы — система мероприятии по оптимизации взаимоотношении человеческого общества и природы. В основе рационального природопользования и охраны природы лежат следующие мотивы: экономический, здравоохранительный, эстетический, научно-познавательный, воспитательный. Экономический мотив – важнейший мотив, ибо вся хозяйственная деятельность человека и само его существование основаны на использовании природных ресурсов. Здравоохранительный мотив – возник относительно недавно в связи с усиливающимся загрязнением окружающей среды, результатом которого являются заболевания и снижение продолжительности жизни человека. Эстетический мотив подразумевает поддержание хотя бы отдельных природных комплексов в состоянии, способном удовлетворять эстетические потребности человека. Научно-познавательный мотив имеет в виду сохранение биологического разнообразия организмов, неизмененных участков природы, ее отдельных произведении с целью ее научного познания. Воспитательный мотив подразумевает необходимость охраны природы для формирования духовных потребностей человека. Конечная цель рационального природопользования и охраны природы – обеспечение благоприятных условий для жизни человека, развития хозяйства, науки, культуры для удовлетворения материальных и культурных потребностей всего человеческого общества. Список использованной литературы 1. Мамонтов С.Г, Захаров В.Б. Общая биология. М.; изд. «Высшая школа», 1996 г. 2. Жданова В. М., Гайдамович С. Я. Общая и частная вирусология, М.; изд. «Молодая гвардия», 1982 г. 3. Коротеев И. А., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, М.; изд. «Специальная литература», 1998 г. 4. Пыльнева Т.Г… Природопользование: учеб. Пособие для вузов. М.; изд. «Финста-тинформ», 1997 г. www.ronl.ru Вирусы растений | Вирусология
 Поскольку вирусы растений, подобно вирусам мицелиальных грибов, не имеют собственного механизма для разрушения клеточной стенки, за них это делают жалящие или грызущие растительноядные беспозвоночные, которые одновременно играют роль векторов. Кроме того, локальное разрушение клеточной стенки может произойти при случайном механическом воздействии, в том числе при трении листьев друг о друга. В отличие от прокариотов, грибов и растений, ядерные клетки (например, некоторые протисты) часто лишены ригидной стенки. Поэтому макромолекулярные комплексы, такие, как вирусы, могут практически беспрепятственно контактировать с поверхностью цитоплазматической мембраны. Однако поскольку ядерные клетки содержат сложную систему внутренних мембран, последние могут стать дополнительным барьером на пути вируса в тот компартмент, где он будет репродуцироваться. Особенно это касается тех вирусов животных и растений, которые размножаются в клеточном ядре. ъВнутриклеточный транспорт между цитоплазмой и нуклеоплазмой обычно осуществляется через комплекс ядерной поры, однако ее диаметр составляет 25 нм, что значительно меньше диаметра большинства капсидов. Поэтому, например, некоторые ретровирусы не способны проникнуть в ядро и остаются в цитозоле до тех пор, пока ядерная оболочка не будет разобрана в прометафазе митоза.
Транслокация вириона с помощью локомоторных систем хозяина. Поскольку вирион не может самостоятельно передвигаться, иногда он использует локомоторные системы клетки-хозяина. В результате индуцированной вирусом перестройки поверхностных придатков (фимбрий у бактерий) или цитоскелета (у эукариотов) обеспечиваются контакт вириона с поверхностью клетки, его внутриклеточный таргетинг и даже его транслокация между клетками ткани. В частности, вирионы ряда бактериофагов (икосаэдрические фаги, содержащие ssPHK, например Q(J и MS2; нитчатые фаги, содержащие ssflHK, например fd и М13; оболочный фаг фб Pseudomonas syringae) адсорбируются на «сократимой» фимбрии, которая осуществляет докинг вириона к поверхности наружной мембраны. Икосаэдрические ssPHK-фаги и фаг фб прикрепляются к боковой поверхности адгезионной фимбрии, а нитчатые фаги — к дистальному концу половой F-фимбрии. Похожие публикации medvit.ru Вирусология 2
Задание 1. Дать понятие и раскрыть историю науки Вирусология. Вирусология – быстро развивающаяся отрасль современной биологии. Её теоретическое и практическое значение для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства – огромно. Вирусология занимает важное место среди медико-биологических наук, так как вирусные болезни широко распространены у человека, животных и растений; кроме того, вирусы служат моделями, на которых изучаются основные проблемы генетики и молекулярной биологии. Изучение вирусов привело к пониманию тонкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению механизмов мутации. Вирус (лат.)- яд. Вирусология - наука о вирусах; субмикроскопических внутриклеточных паразитах. В середине XXв. вирусология выделилась в самостоятельную дисциплину. В результате наблюдений Д.И.Ивановский и В.В.Половцев впервые высказали предположение, что болезнь табака, так называемой табачной мозаики, представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения: одно из них - рябуха , возбудителем которого является грибок, а другое неизвестного происхождения. Д.И.Ивановский пришел к выводу, что мозаичная болезнь табака вызывается бактериями, проходящими через трубочки очень маленького диаметра (фильтры Шамберлана), которые не способны расти на искусственных субстратах. Возбудитель мозаичной болезни называется Ивановским то “фильтрующимися” бактериями, то микроорганизмами, так как сформулировать сразу существование особого мира вирусов было весьма трудно. Д.И.Ивановский открыл вирусы - новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вируса, цитопотологических вирусных инфекций, фильтрующихся форм микроорганизмов, хронического и латентного вирусоносительства. Строение и свойства вирусов Вирусы обитают только в клетках, это внутриклеточные паразиты. В свободном, активном состоянии они не встречаются и не способны размножаться вне клетки. Если у всех клеточных организмов обязательно имеются две нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК, то вирусы содержат только одну из них. На этом основании все вирусы делят на две группы: ДНК-содержащие и РНК-содержащие. ДНК находится в вирусах животного и человека. РНК находятся в вирусах растении. В отличие от клеточных организмов у вирусов отсутствует собственная система, синтезирующая белки. Вирусы вносят в клетку только свою генетическую информацию. Молекула ДНК вирусов, или их геном, может встраиваться в геном клетки хозяина и существовать в таком виде долгое время. Таким образом, паразитизм вирусов носит особый характер – это паразитизм на генетическом уровне. Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В среднем они в 50 раз меньше бактерий. Их нельзя увидеть в световой микроскоп, так как их длины меньше длины световой волны. Схематический разрез вируса    дополнительная оболочка    капсомер сердцевина Вирусы состоят из различных компонентов: а) сердцевина генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу. б) белковая оболочка, которую называют аспидом. Оболочка часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии. в) дополнительная липопротеидная оболочка. Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес). Полностью сформированная инфекционная частица называется вирионом. Положения о том, что вирусы представляют собой полноценные организмы, позволило окончательно объединить все три названных группы вирусов - вирусы животных, растений и бактерий - в одну категорию, занимающую определенное место среди живых существ, населяющих нашу планету. Тот факт, что их не удалось выращивать на искусственных питательных средах, вне клеток, не вызывал особого удивления, так как вирусы с самого начала были определены как строгие внутриклеточные паразиты. Это свойство признавалось не уникальным, присущим только вирусам, поскольку внутриклеточные паразиты известны и среди бактерий, и среди простейших. Как и другие организмы, вирусы способны к размножению. Вирусы обладают определенной наследственностью, воспроизводя себе подобных. Наследственные признаки вирусов можно учитывать по спектру поражаемых хозяев и симптомам вызываемых заболеваний, а также по специфичности иммунных реакций естественных хозяев или искусственных иммунизируемых экспериментальных животных. Сумма этих признаков позволяет четко определить наследственные свойства любого вируса, и даже больше - его разновидностей, имеющих четкие генетические маркеры, например: нейтропность некоторых вирусов гриппа, сниженную патогенность у вакциональных вирусов и т.п. Изменчивость является другой стороной наследственности, и в этом отношении вирусы подобны всем другим организмам, населяющим нашу планету. При этом у вирусов можно наблюдать как генетическую изменчивость, связанную с изменением наследственного вещества, так и фенотипическую изменчивость, связанную с проявлением одного и того же генотипа в разных условиях. Примером первого типа изменчивости являются мутанты одного и того же вируса, в частности температурочувствительные мутанты. Примером второго типа изменчивости служит разный тип поражений, вызываемых одним и тем же вирусом у различных животных, растений и бактерий. Все вирусы по своей природе - паразиты. Они способны воспроизводить себя, но только внутри живых клеток. Обычно вирусы вызывают явные признаки заболевания. Попав внутрь клетки, они “включают” ее ДНК и, используя свою собственную ДНК или РНК, дают клетке команду синтезировать компоненты вируса. Компоненты вируса способны к спонтанному образованию вириона. Клетка, израсходовав все жизнетворные соки на синтез вирусов, гибнет, перегруженная паразитами. Вирусы “разрывают” оболочку клетки и передаются в другую клетку в виде инертных частиц. Вирусы вне клетки представляют собой кристаллы, но при попадании в клетку “оживают”. Вирусы, как и другие организмы, характеризуются приспособляемостью к условиям внешней среды. Нужно только не забывать, что для них организм хозяина является средой обитания, поэтому многие условия внешней среды влияют на вирус опосредованно - через организм хозяина. Однако многие факторы внешней среды могут и непосредственно воздействовать на вирусы. Достаточно вспомнить уже названные температурочувствительные мутанты вирусов, которые, например, размножаются при температуре 32-37. С и гибнут при температуре 38-40. С, хотя их хозяева остаются вполне жизнеспособными при этих температурных режимах. В связи с тем, что вирусы являются паразитами, они подчиняются закономерностям и к ним применимы понятия экологии паразитизма. Каждый вирус имеет круг естественных хозяев, иногда очень широкий, как, например, у мелких РНК-геномных фагов: в первом случае поражаются все млекопитающие, во втором - отдельные клоны кишечной палочки. Циркуляция вирусов может быть горизонтальной (распространение среди популяции хозяев) и вертикальной (распространение то родителей потомству). Таким образом, каждый вирус занимает определенную экологическую нишу в биосфере. Задание 2. Охарактеризовать группу живых организмов и их роль в природе и для человека (привести примеры). Вирусы – внутриклеточные паразиты растений. Роль микроорганизмов в природе и хозяйственной деятельности человека. Био - повреждения косметических средств. Для изготовления косметических средств используют жиры, смолы, эфирные масла, спирты, витамины, гормоны, ферменты, глицерин, а также экстракты растений, которые являются хорошей питательной средой для микроорганизмов, поэтому 25% косметических средств содержат живые микроорганизмы. Во всех группах сырья встречают споровые, палочки, кокки-стафилококки, бактерии группы кишечной палочки. В результате размножения микроорганизмов в косметических средствах наблюдается изменение цвета и консистенции. Био-повреждения текстильных волокон. Хлопок состоит из целлюлозы - это волокна длиной до 40 мм, покрывающие семена, растения хлопчатника. Может подвергаться разложению со стороны пектиновых бактерии. Льняное волокно и шелк также подвергаются порче микроорганизмами. Целлюлозные бактерии разрушают все материалы содержащие клетчатку. При условиях повышенной влажности характерно плесневение. Гнилостные бактерии вызывают распад целлюлозы. Кожа и мех. Бактерии возникают в результате заболевания животных, загрязнении кожного покрова, неполноценного кормления животного. Оспины появляются после того, как животное переболело оспой. Порша - кожные покровы покрываются струпьями. Отслаивание – гнилостное разложение, которое возникает при разложении масляно-кислых бактерии. mirznanii.com
|
