Генетическая трансформации растений: молекулярные механизмы, методы и практика. Трансформация растений

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ | Наука и жизнь

Регенерация трансгенного растения из неорганизованной массы делящихся генетически транформированных клеток.

Схема агробактериальной трансформации.

‹

›

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Признаки, которые возможно придать с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов. Очень условно их можно разделить на три группы. К первой относятся признаки, интересные производителям: устойчивость к различным факторам окружающей среды - гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению, улучшение минерального питания, повышение укореняемости. Вторая группа признаков представляет интерес непосредственно для потребителей - модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветков, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-"биофабрики", способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие полезные вещества.

ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придает, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придает устойчивость к определенным веществам (чаще всего - антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда - репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетов ом свете.

В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК.

Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом - на полях и в теплицах.

Создание одного нового сорта ГМР стоит от 50 до 300 млн долларов и занимает от 6 до 12 лет.

www.nkj.ru

Генетическая трансформация растений

Развитие генетической инженерии растений

Традиционные методы селекции, основанные, главным образом, на половой гибридизации и отборе, позволяют получать новые генотипы растений. Они обеспечивают получение огромного числа сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, в том числе шедевров селекции. Выдающиеся селекционеры России (Лукьяненко, Пустовойт, Ремесло, Гаркавый, Кириченко, Калиненко и др.) внесли решающий вклад в эти достижения. Классические методы селекции и в дальнейшем будут составлять основу получения новых сортов. Генно-инженерные манипуляции позволяют решать ряд важных задач по повышению устойчивости новых форм, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений к патогенам и сокращению продолжительности выведения новых сортов.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как прокариотического, так и эукариотического происхождения, переносит этот ген (или несколько генов) в хромосомы реципиентного растения обеспечивать его экспрессию. Применение этой технологии делает поиск более целенаправленным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом.

Важным преимуществом растений по сравнению с животными является возможность получения целого растения из одной клетки, основанная на свойстве тотипотентности. Результаты генетической инженерии растений во многом зависят от разработки методов культуры тканей, особенно методик регенерации различных растений.

Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений:

1) выбор гена и его клонирование;

2) подбор генотипа растения-реципиента;

3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента;

4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений.

Трансформация растений с помощью агробактерий

Одной из основных проблем при получении трансгенных растений был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений, т.е. трансформация растительных клеток. Значительный прорыв был сделан при открытии возможности использования природной системы трансформации растений Тi-плазмидами почвенных агробактерий.

Ранее было известно, что некоторые виды почвенных бактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения и вызывать при этом образование специфических опухолей-корончатых галлов. Опухоли состоят из недифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Если после заражения все агробактерии инактивировать добавлением антибиотика, то клетки корончатых галлов сохраняют способность к неконтролируемому делению. Итак, присутствие агробактерий необходимо только для индицирования образования опухоли. Опухолевые клетки начинают синтезировать необычные для растения аминокислоты-опины (производные аргинина), которые используются агробактериями в качестве источника азота и углерода. Таким образом, при заражении растения агробактерий происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.

Тi –плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК длиной ≈ 200 т.н.п. В бактериальных клетках они способны реплицироваться автономно. Тi –плазмиды могут быть разделены на четыре группы по типу синтезируемых ими опинов. Чаще всего встречаются тi –плазмиды, кодирующие аминокислоты нопалин или октопин. Причем агробактериальная клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.

Генетические исследования показали, что Тi- плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: 1). Необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т.д ) 2). Необходимые для трансформации растительной клетки. При этом следует особо отметить, что гены первой группы имеют прокариотический тип промотора и могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы могут работать в растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опинов.

Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит следующим образом. Было показано, что агробактерия не входит в растительную клетку, не входит в нее и Тi-плазмида, но часть Тi-плазмиды переносятся в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Тi- плазмиды был назван Т-ДНК (от англ. Transforming DNA- трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые повторы (25н.п), которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Область Т-ДНК несет семь генов: ген, кодирующий синтез одного из опинов, а также шесть генов, кодирующих признаки опухолеобразования, причем два из них кодируют синтез ауксина, а один- синтез цитокинина. В результате экспрессии этих генов в трансформированных клетках меняется гормональный статус, что приводит к их дифференцировке и опухолеобразованию.

Процесс трансформации растения начинается с того, что агробактерии прикрепляется к растительной клетке в области поражения последней. При поранении растительная клетка выделяет во внешнюю среду специфическое фенольное соединение -ацетосиренгон. Итак, методы в то или ином сочетании позволяют получить многие гены, продукты которых- белки- известны и могут быть выделены хотя бы в малом количестве. Эти гены в дальнейшем могут стать объектом генно- инженерных манипуляций, задача которых получить их экспрессию в новом генетическом окружении.

Источники генов для улучшения растений

Генетический код един для всех живых существ. Круг источников генов, которые могут быть использованы для улучшения свойств культурных растений, не органичен миром растений. Гены, выделенные из различных царств, семейств и отрядов живых организмов могут работать в представителях любых других царств, семейств и отрядов.

Например, ген белка GFP, выделенный из морской медузы и светящийся в ультрафиолете, успешно работает в трансгенных растениях, помогая отслеживать процесс трансформации и селекции. Гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, выделенные из микроорганизмов, служат маркерами трансформации в растениях.

Существенно удешевили получение урожая гены устойчивости к гербицидам и насекомым. Известно, что для борьбы с сорными растениями, конкурирующими с культурными, требуются значительные средства. Если иметь культуры, устойчивые к гербицидам, последними можно обрабатывать посевы, и уничтожать сорняки без вреда для культурных растений.

Ген bar, выделенный из бактерии, определяющий устойчивость к гербициду «Баста», был введен и апробирован на ряде важнейших культур, в том числе на злаках и сахарной свекле.

В течение нескольких десятилетий для борьбы с насекомыми использовалась культура бактерий Bacillus thuringiensis (Bt). После обработки этой культурой растения не подвергались атакам насекомым. Оказалось, что действенным началом бактерии являются токсичные для насекомых белки, препятствующие всасыванию пищи.

В таблице 1 представлены данные об источниках генов устойчивости к насекомым-вредителям. Трансгенный картофель с генами Bt показал надежно наследуемую устойчивость к колорадскому жуку и получил широкое распространение в странах, страдающих от этого насекомого. С 1997 года во Франции проводятся испытания трансгенной Bt-кукурузы, устойчивой к стеблевому мотыльку.

Таблица 1. Источники генов токсинов из Bt, защищающие растения от насекомых-вредителей.

Полевые испытания трансгенного картофеля, созданного в лаборатории генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН, показали сохранность признака устойчивости к колорадскому жуку в течение не менее трех вегетативных поколений.

Безопасность генетически модифицированных растений

Создание ГМР - высоко технологический процесс, основанный на фундаментальных научных знаниях, требующий высококвалифицированных кадров и мощной современной инструментальной базы. Трансгенное растение создается в научных лабораториях, проходит стадию испытаний в теплицах и в полевых условиях, затем государственные сортоиспытания, регистрацию и, наконец, выходит на рынок: для выращивания в окружающей среде; употребления в пищу непосредственно или в переработанном виде; в качестве кормов для животных, или как источник лекарств-«съедобных» вакцин.

Стратегия биобезопасности основывается на научном исследовании особенностей ГМР, опыте обращения с ними, а также информации о его предполагаемом использовании и окружающей среде, в которую ГМР будет интродуцировано. Совместными многолетними усилиями международных организаций (ЮНЕП), экспертов из разных стран, в т.ч. России, были разработаны базовые понятия и процедуры:

«Опасность» - потенциальная возможность ГМР причинить вред здоровью людей или окружающей среде.

«Риск» - вероятность реализации опасности, если она определена, при высвобождении ГМР в потенциальную принимающую среду. Очень важно определить, в чем фактически состоят риски. При этом учитываются два особых фактора: последствие конкретного события и вероятность наступления события.

«Оценка рисков» - меры по оценке того, какой вред может причинен, как он может проявиться и какими могут быть масштабы предполагаемого ущерба. Оценка рисков должна проводится строго на научной основе, при этом каждое новое ГМР рассматривается индивидуально, поэтапно и в сравнении с исходным не модифицированным растением. Международными и российскими правилами требуется применение «принципа предосторожности» в тех случаях, когда полная информация отсутствует.

biofile.ru

Генная инженерия растений с помощью Agrobacterium. Прямые методы генетической трансформации растений.

Непосредственный перенос гена в чужеродный геном получил название генетическая трансформация. Система, обеспечивающая такой перенос, получила название вектор.

Плазмидные векторы. В качестве векторов используются плазмиды бактерий и для трансформации растений чаще всего Ti – плазмида (от англ. tumor induction) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. В природных условиях Agrobacterium tumefaciens проникают в клетки корней растений и там размножаются. При этом часть плазмидной ДНК (T-ДНК) встраивается в хромосомы поврежденных (зараженных) клеток, индуцируя образование галлов (опухолей). Это естественный вектор переноса ДНК. При трансформации растений используют так называемую разрушенную Ti-плазмиду, которая лишена онкогенов, вызывающих образование галлов. Вместо этих генов в плазмиду ―встраивают интересующие исследователя гены, а также так называемые репортерные гены, позволяющие убедиться во встраивании T-ДНК в геном растения, в результате экспресссии которых, трансформированная клетка становится устойчивой к антибиотикам канамицину, метатрексиату и гигромицину В.

При культивировании трасформированных клеток на среде с данным антибиотиком, выживают только клетки, у которых Т-ДНК включена в геном. Помимо ―встроенных генов Ti-плазмида должна содержать гены vir-областей, обеспечивающих сам процесс встраивания T-ДНК в хромосому. В последующем была создана, так называемая, бинарная система трансформации, состоящая из небольшой, реплицирующейся как в E.coli, так и в A.tumefaciens, плазмиды, несущей переносимые гены, и Ti-плазмиды, несущей vir-гены с делетированной Т-ДНК. Считается, что с использованием A.tumefaciens легче трансформировать двудольные растения (горох, табак и т.п.), чем однодольные (пшеница, кукуруза). Но это уже зависит от избранного метода трансформации. Вообще же к настоящему времени создано огромное число плазмид, которые используются в качестве векторов при трансформации как растений, так и животных.

Вирусные векторы. В целях трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Однако их набор ограничен. Это объясняется тем, что у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых, как вирус мозаики цветной капусты (СаМV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостатком вирусных векторов является ограниченная протяженность встраиваемых генов ( от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформировании растений, относящихся к семейству крестоцветных.

Безвекторные системы.

Генная пушка. Этот метод носит название «биологической баллистики». Он заключается в обстреле из вакуумной пушки (генная пушка) суспензий клеток растений, протопластов и каллусов. Обстрел растительных тканей производят частицами золота или вольфрама (диаметр 0,6 – 1,2 мкм), на которые нанесена чужеродная ДНК. Растительные клетки располагают на специальной целлофановой пластине. Частицы металла пронизывают клетки, оставляя в них ДНК. Трансформируется при этом около 10-15% клеток, часть из которых регенерирует в нормальные растения. И хотя процесс трансформации все же носит случайный характер, к настоящему времени этим способом получены трансгенные растения, преимущественно из однодольных культур (кукуруза, рис, пшеница и др.).

Метод электропорации. Это один из методов прямого введения ДНК в клетку. Растительные клетки погружают в среду с находящейся в ней чужеродной ДНК. Через эту среду пропускают (доли секунды!) электрический ток с напряжением 250-300 В. Через расширившиеся поры ядерной мембраны чужеродная ДНК проникает в ядра и включается в хромосомы.

Микроинъекции. С помощью микроигл (наружный диаметр 2 мкм) чужеродную ДНК вводят в ядра клеток, закрепленных на стекле при помощи полилизина.

Использование «агентов слияния». В качестве «агентов слияния» используют положительно заряженные сферы липидов (липосомы), которые обволакивают векторную ДНК, защищая ее от действия нуклеаз. Находящаяся в липосомах ДНК проникает с их помощью в растительные клетки и включается в геном.

infopedia.su

Агробактериальная трансформация — это, что такое, какие, определение, значение, доклад, реферат, конспект, сообщение, вики — WikiWhat

Содержание (план)

Агробактериальная трансформация — метод получения трансгенных растений путём введения Агробактериума (Agrobacterium) — почвенной бактерии, образующей опухоль при заражении растений.

Внедрение в жизнь биотехнологии целенаправленного получения трансгенных растений ускорила стыковка методов получения эмбриональных тканей из расти­тельных клеток и тканей посредством использования искусственных питательных сред, витаминов, гормонов и микроэлементов и выра­щивания этих тканей до зрелого растения с достижениями генетической инженерии.

Основной недостаток классического генетического метода изменения наследственности состоит в том, что при скрещивании двух организмов с разными генотипами происходит взаимная рекомбинация их ценных и не ценных в хозяйственном отношении генов. В результате в созданный сорт будут переходить, кроме тех генов, которые были желательны для генетика-исследователя, и гены, ухудшающие свойства сорта.

При применении метода агробактериальной трансформации данная проблема легко разрешается.

Заражение агробактерией

В клетку растения, сорт которого хотят улучшить, вводится ценный ген и из этой клетки выращивается зрелое растение. Для введения в клетку определённого гена в качестве векторной молекулы пользуются плазмидой почвенной бактерии Агробактериум. В природе при заражении этим видом бактерии растения повреждаются. В результате беспорядочного деления клеток заражённого растения на нем развивается опухоль, которая вызывается отрезком ТДНК (ДНК, вызывающая опухоль) генома Ti-плазмиды. В основе появления опухоли лежит встраивание ТДНК в геном растительной клетки и изменение ею свойств клетки (рис. 11). Эта особенность ТДНК широко используется в генной инженерии.

Векторные конструкции

Довольно большой размер Ti-плазмиды Агробактериума (более 20 тысяч нуклеотидных пар) несколько затрудняет её использование в генной инженерии. Поэтому для перестройки наследственности растения методом генной инженерии при помощи рестриктазы получают отрезок ТДНК, плазмиды которого соединяют с плазмидой pBR 322 (пи-би-эр 322) и клонируют. Созданная искусственная плазмида несколько меньше, чем Ti-плазмида, и использование её намного легче и эффективнее. Такие молекулы (созданные искусственные плазмиды) называются векторными конструкциями. На отрезок ТДНК векторной конструкции пересаживают растительный ген. В результате этого ТДНК теряет способность вызывать опухоль, так как она уже разделена на два отрезка чужеродным геном.

Векторная конструкция, содержащая расчленённые ТДНК и чужеродный ген, внедряется в безвредные для растения специальные штаммы Агробактериума, Ti-плазмида которого не содержит ТДНК. При заражении растений этими бактериями Ti-плазмида Агробактериум с помощью своего специального аппарата трансформации встраивает чужеродный ген в геном растения. В последние годы разработаны методы внедрения в растительную или животную клет­ку чужеродного гена в составе векторной конструкции с помощью сверхмощного электрического поля или генных пушек. Однако эти методы применяются только в особых случаях из-за их технической сложности и дороговизны.

Получение трансгенного растения

Из растительной клетки, подвергнутой трансформации, получают трансгенное растение (рис. 12). Материал с сайта http://wikiwhat.ru

Путём соединения Ti-плазмиды (1), полученной из Агробактериума, с плаз­мидой (2) с уникальным рестрикционным сайтом создаётся векторная конструкция (3). В отрезок ТДНК векторной конструкции рекомбиниру­ется чужой ген (4) и получается вектор (5) на основе Ti-плазмиды, не способной образовать опухоль. Этот вектор вво­дится в специальный штамм Агробак­териума c Ti-плазмидой, не содержащей участок ТДНК (6). При выращивании в искусственных условиях созданной рекомбинантной агробактерии (7) вмес­те с протопластом растения вектор (8) рекомбинируется в геноме растения.

Каллусная ткань

В результате деления трансформированной растительной клетки образуется набор клеток, которые развиваются по определённой программе. Такой набор называется каллусной тканью. Отдельные клетки каллусной ткани под действием растительных гормонов или других регуляторных веществ начинают делиться по заданной программе. В результате из таких клеток поэтапно получают ткани растительного эмбриона и нормальное во всех отношениях, зрелое трансгенное растение. В хромосомах каждой его клетки содержится пересаженный ген. Поэтому, когда разведение трансгенного растения производится половым путём, пересаженный чужеродный ген передаётся по наследству.

Методом агробактериальной трансформации, например, выведены сорта хлопчатника и картофеля, которые отличаются устойчивостью к коробочному червю и колорадскому жуку.

Картинки (фото, рисунки)

• 

  Рис. 11. Образование опухоли на растениях при заражении их некоторыми видами Агробактериума под воздействием отрезка ТДНК Ti-плазмиды. ТДНК, рекомбинируясь в хромосому растения, нарушает программу деления растительной клетки

• 

  Рис. 12. Основные этапы полу­чения трансгенного растения

• В трансгенном растении чужеродный генпередается по наследству

• Значение в жизни человека агробактерий

• Тднк и зп

• Агробактериальный метод это

• Агробактериальная трансформация растений почему только на однодольных

• По какой причине ТДНК теряет свои функции при внедрении чужеродного гена в отрезок ТДНК, в котором находится Ti-плазмида?

• Укажите порядок процесса изменения наследственности растения методом агробактериальной трансформации.

wikiwhat.ru

Методы трансформации растительных клеток - Справочник химика 21

    Микроинъекции ДНК. В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применяться для трансформации растительных клеток аналогично микроинъекциям в животные клетки. Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином. [c.61]

    В настоящей главе мы надеемся дать представление о взаимодействии между агробактериями и растительными клетками, которое приводит к успешной трансформации. Предложенные методики различаются главным образом выбором векторной системы, типом эксплантата, методами селекции трансформированных тканей и регенерации трансформированных растений. В этой главе подробно описаны различные подходы к генетической трансформации растений векторами на основе агробактерий при использовании в качестве модельных систем табака, льна и моркови и рассмотрены главные факторы, которые необходимо учитывать при попытках адаптировать любую методи- [c.87]

    Несмотря на то что нуклеиновые кислоты были открыты еще в 1865 г. и долгое время привлекали внимание многих исследователей, их роль в жизни клетки оставалась совершенно неясной. На их фундаментальное значение в процессах жизни указывало, во-первых, их присутствие в составе пе только растительных п животных клеток, но и бактерий и вирусов и, во-вторых, их локализация в клетках, изученная гистохимическими методами. Однако сущность их роли оставалась загадкой до тех пор, пока не обнаружили, что вещество, ответственное за трансформацию пневмококков, является полинуклеотидом [1, 3, 10, 13, 14]. [c.299]

    Был рассмотрен метод трансформации растительньгх клеток при помощи микроорганизмов рода Agroba terium. Существует еще ряд методов, например свободное поглощение чужеродного генетического материала в процессе ко-культивирования с растительными клетками, инъекция ДНК в растительные клетки и целые растения и др. В результате разработанных методов генетическая инженерия получила возможность надежной трансформации ряда растений, в том числе и сельскохозяйственных культур. Так, имеются хорошие [c.505]

    Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

    Из генома В. thuringiensis бьш выделен ген токсина Ы2 и поставлен под контроль промотора 35S aMV. 6 -Ген был интегрирован в геном растений табака методом агробактериальной трансформации. Экспрессия бактериального Ы2-тт в растительных клетках была подтверждена как на уровне транскрипции, по присутствию соответствующей мРНК, так и на уровне трансляции, по синтезу белка-токсина. Полученные трансгенные растения табака бьши устойчивы к вредителям. Эффективность защиты сельскохозяйственных культур от вредителей была показана и на трансгенных растениях томата, трансформированных генами эндотоксина, при этом бактериальный белок, синтезированный в тканях растений, обеспечивал защитный эффект, сравнимый с использованием инсектицидных препаратов. [c.71]

    Следует учитывать две основные особенности маркерных генов. Во-первых, их структуру (нуклеотидную последовательность), которая определяет такие факторы, как регуляция транскрипции (конститутивная экспрессия или включение под действием определенных внешних условий или стадии развития), скорость транскрипции, стабильность транскрипта и эффективность трансляции. Во-вторых, активность продукта данного гена, который, очевидно, отвечает за доминантную экспрессию подходящего селективного фенотипа. В большинстве обычных векторов трансформации в качестве селективных маркеров используют прокариотические ферменты устойчивости к антибиотикам, которые были адаптированы с помощью генно-инженерных методов для конститутивного синтеза в растительных клетках (табл. 2.1). В некоторых экспериментах в качестве доминантных маркеров успешно использовались ферменты, обеспечивающие защиту от гербицидов. Обычно добиваются слияния кодирующей последовательности фермента с промоторами, выделенными из Т-ДНК или генома вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), на 5 -конце, а на З -конце —с сигналом полиаденилирования (тоже полученным, как правило, из какого-либо гена Т-ДНК). В качестве маркерных генов наиболее широко используют гены устойчивости к таким антибиотикам, как канамицин, G418 [8, 27], гигромицин [54] и блеомицин [28] Недавно для трансформации растительных клеток в качестве доминантных маркеров были попользованы гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, таким, как глифосат [45]. Поскольку селективные маркерные гены нормально функционируют в трансформированных [c.33]

    Структура таких векторов стандартна. Они содержат все необходимые элементы для манипулирования ими в клетках Е. oli, маркер для селекции растительных трансформантов и полилинкер (рис. 12.5,а). Особенно важно отметить, что эти векторы можно использовать для трансформации протопластов как однодольных, так и двудольных растений. Их небольшой размер (несколько т.п.н ) позволяет достигать достаточно высокого уровня трансформации (10 —10 ) при введении рекДНК в протопласты с помощью полиэтиленгликоля, липосом и методом электропорации. Апробирован также метод прямой микроинъекции рекДНК в ядра протопластов. Частоты трансформации при этом [c.382]

chem21.info

Генетическая трансформации растений: молекулярные механизмы, методы и практика.

Транскрипт

1 Генетическая трансформации растений: молекулярные механизмы, методы и практика. Профессор, д.б.н., А.К.Гапоненко, Главный научный сотрудник Института Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН.

2 В одной лекции невозможно даже коротко изложить современное положение и перспективы генетической инженерии растений. Мы рассмотрим следующие, на наш взгляд, наиболее интересные вопросы. 1. Каковы теоретические основы генетической инженерии? 2. Начало эры генетической инженерии растений, ее основатели. 3. Что такое рестрикционные ферменты 4. Понятие о плазмидах и векторах 5. Основные этапы генных манипуляций 6. Клонирование генов 7. Маркерные и селективные гены 8. Как это делается? Агобактериальная и биобаллистическая генетическая трансформация 9. Некоторые научные результаты. 10. Наиболее впечатляющие практические свершения.

3 ЭРА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ НАЧАЛАСЬ 18 ЯНВАРЯ 1983 ГОДА НА СИМПОЗИУМЕ В МАЙАМИ, США (MIAMI WINTER SYMPOSIUM) Мари-Делл Хилтон, Университет штата Вашингтон, Сиэтл, США, доложила о получении растений табака, устойчивых к антибиотику канамицину. Джеф Шелл и Марк ван Монтегю, университет Гент, Бельгия, сообщили о создании растений табака, устойчивых к канамицину и метатриоксату, Роберт Фралей и Роберт Хорч, компании Монсанто, Сант-Льюса, штат Миссури, США, получили растения петунии устойчивые к канамицину. Во время одной сессии, Джефф Шелл, Роб Horsch от Monsanto, и я доложили об исследованиях Agrobacterium и ее адапт ации как вект ора для т рансформации раст ений. Все т рое сообщили, об успехе химерного гена уст ойчивост и к канамицину в качест ве селект ивного маркера для раст ит ельных клет ок. БЫЛО ЯСНО, ЧТО ПРОГРЕСС, ПОЛУЧЕННЫЙ ВО ВСЕХ ТРЕХ ГРУППАХ, ДЕЛАЕТ РЕАЛЬНОСТЬЮ УЛУЧШЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. Mary-Dell Chilton Plant Physiology, January 2001, Vol. 125, pp. 9 14, American Society of Plant Physiologists Проф. А.К.Гапоненко 3 3

4 Основатели генетической инженерии растений: Мари Дел- Хильтон, 2005: «В конце-концов трансформирующая бактерия, какое бы ни имя ей не было, всего лишь маленький кусочек технологии необхо-димой для создания трансгенного растений». Джеф Шелл, Первая его статья, написанная в соавторстве с Марком Ван Монтегю, о ДНК Agrobacterium опубликована в 1972 и посвящена фагам Agrobacterium. Марк Ван Монтегю Решение Шелла изучать как Agrobacterium tumefaciens, почвенная бактерия вызывает опухоли у растений, явилась ключом к тому прогрессу, который мы достигли за последние 30 лет Тимоти Холл Dr. Timothy C. Hall Distinguished Professor of Biology Director, Institute of Developmental and Molecular Biology Texas A&M University Dr. Robert T. Fraley Executive Vice President and Chief Technology Officer Robert Horsch Апрель 1983 года, ген запасного белка фасоли успешно экспрессировались в клетках подсолнечника, после переноса его посредством плазмиды агробактерии. Проф. А.К.Гапоненко 4

5 Agrobacterium tumefaciens - бактерия и «корончатые галлы» - болезнь которую она вызывает Цитируется по Проф.Vitaly Citovsky Проф. А.К.Гапоненко 5 5

6 Генная инженерия в природе. Заболевание «корончатых галл» растений известно с времен Аристотеля. В 1907 году Е.Смит и К.Таудсен показали, что это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens Общая схема «генетической колонизации» (Shell et al.,1983) Agrobacterium tumefaciens растения и образование опухоли. Проф. А.К.Гапоненко 6 6

7 Что такое генная инженерия? Непосредственное изменение структуры и характеристик генов так, чтобы управлять биологическими процессами организмов на благо людей т.е. ИЗМЕНЯТЬ ГЕНЕТИЧЕСКУЮ ПРОГРАММУ ОРГАНИЗМОВ. Генная инженерия также известна, как технологии рекомбинантных ДНК или манипуляции с генами (клонирование генов) для получения Генетически Модифицированных Организмов (ГМО) с новыми агрономическими и потребительскими свойствами. Возможны различные виды генетической модификации: Перенос чужеродного гена из одного вида в другой; Изменение существующих генов так, чтобы их продукты изменялись; ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ТАК ЧТОБЫ ОНИ БОЛЕЕ ЧАСТО ТРАНСЛИРОВАЛИСЬ ИЛИ ВООБЩЕ ЗАМОЛКАЛИ (НОКДАУН ГЕНОВ) Проф. А.К.Гапоненко 7

8 СРЕДСТВА ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Проф. А.К.Гапоненко 8

9 1. Рестрикционные ферменты В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками опубликовали первую работу о получении in vitro (в пробирке, вне организма) рекомбинантной (гибридной) молекулы ДНК, состоящей из фрагментов фаговой, бактериальной и вирусной ДНК. Так родилась новая ОТРАСЛЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, ПОЛУЧИВШАЯ НАЗВАНИЕ "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ (ГЕННАЯ) ИНЖЕНЕРИЯ". Своей целью она имеет создание новых генетических структур и, в конечном счете, создание организмов с новыми наследственными свойствами.

10 1. Рестрикционные ферменты Разрезающие ДНК ферменты (МОЛЕКУЛЯРНЫЕ НОЖНИЦЫ) Рестрикционные эндонуклеазы разрезают ДНК в специфичных сайтах (местах), определяемых последовательностью оснований в ДНК (сайты узнавания) образуя липкие концы in vitro притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул. Такие комплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами. ТАКИМ ОБРАЗОМ, ЕСЛИ В ПРОБИРКУ ПОМЕСТИТЬ САМЫЕ РАЗНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК С ОДИНАКОВЫМИ ЛИПКИМИ КОНЦАМИ, ТО БУДЕТ ПРОИСХОДИТЬ РЕКОМБИНАЦИЯ, ДАЖЕ ЕСЛИ ВСЯ ИХ СТРУКТУРА ОЧЕНЬ РАЗЛИЧАЕТСЯ. Проф. А.К.Гапоненко 10

11 1. Рестрикционные ферменты 1. В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром. 2. Палиндром Фета «А роза упала на лапу Азора». 3. Уникальные последовательности нуклеотидов, являющиеся субстратом для рестриктаз, характеризуются большим разнообразием первичной структуры. 4. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК). 5. Рестриктаза BamHI разрезает 5' GGATCC 3 3' CCTAGG5 Рестриктаза HaeIII разрезает 5'GGCC3 3'CCGG5' 6. Несколько сотен эндонуклеаз выделены из бактерий и многие используются в исследовании ДНК и генной инженерии, такие как: EcoR1, Hind III, HaeIII, TaqA1, Sau3A

12 Открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид. Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся в клетке в виде нескольких копий. Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.

13 2. Плазмиды Молекулы ДНК, найденные в бактериях Действуют как системы для переноса генетического материала другим бактериям, позволяя им эксрессировать перенесенные гены Маленькие - несколько тысяч пар оснований, кольцевые (но могут быть и линейные) Обычно несут один или несколько генов Имеют один район инициации репликации (участок ДНК определенной последовательности в геноме, в котором репликация инициируется Может выживать при определенной концентрации селективного антибиотика Примеры: pbr322, Ti plasmid, puc19, BAC, etc. Проф. А.К.Гапоненко 13

14 3. Вектора Носители ДНК (могут переносить рднк в клетку-хозяина) Внутри клеток хозяина, вектора могут реплицироваться продуцируя множество идентичных копий сегмента ДНК (клоны) Клетки хозяина передают рекомбинантную молекулу ДНК своему потомству Клонированные сегменты ДНК выделяют из клеток хозяина для очистки и анализа Размер вектора должен быть не большим ( <10kb), иметь инициатор репликации и способны реплицироваться в клетке хозяина Вектором может быть плазмида, вирусный геном или хромосома дрожжей Проф. А.К.Гапоненко 14

15 3. Вектора p ОБОЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИД, B и R по имени создателей Bolivar и Rodriguez Плазмида имеет двуспиральную (ds) ДНК - ds-dna 4361 BP (пар оснований Содержит район репликации и селективные гены: amp R и tet R, устойчивости к антибиотикам Имеет уникальные сайты рестрикции Pst I, EcoR I, Hind III, Sal I и Cla I Число копия на клетку высоко (20 30) Может нести вставку ДНК величиной 1-5kb Проф. А.К.Гапоненко 15

16 Основные этапы генных манипуляций Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде. 1. Вектор переносит ген в клетку-хозяина (как правило, бактерия Escherichia coli). 2. В клетке-хозяина вектора размножаются, производя многочисленные идентичные копии не только себя, но гена, который несет вектор. 3. Когда клетка-хозяин делится, копии рднк передается по наследству. 4. После нескольких клеточных делений, образуются колонии идентичные клеткам-хозяина (клоны). Каждая ячейка в клоне содержит один или более копий рднк Проф. А.К.Гапоненко 16

17 Основные этапы генных манипуляций Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде. Фрагмент ДНК, содержащий ген, который необходимо клонировать, вставляется в кольцевую молекулу ДНК, которая называется вектором, для получения рекомбинантных ДНК или (рднк) Гибридизация in vitro молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул (до12 нуклеотидов). Такие комплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так как две молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами. Таким образом, если в пробирку поместить самые разные молекулы ДНК с одинаковыми липкими концами, то будет происходить рекомбинация, даже если вся их структура очень различается. Рисунок Лещинской И.Б., Генетическая инженерия, 1996, Соровский образовательный журнал, 1, Проф. А.К.Гапоненко 17

18 Основные этапы генных манипуляций клонирование гена интереса Проф. А.К.Гапоненко 18

19 Схема строения Agrobacterium tumefaciens и генетическая карта Ti плазмиды (Tumor inducing) вызывающая опухоли. T-DNA (transferred DNA) ДНК, переносимая в ядро клетки растения Л и П левая и правая границы Т-области (right и left borders, RB и LB) с прямыми повторами длиной 25 пн Область, содержащая vir-гены, контролирует синтез и перенос Т-ДНК в растения Область оri точка начала репликации Проф. А.К.Гапоненко 19

20 Список «Разоруженных» линий агробактерии», лишенных генов аналогов фитогормонов ауксинов и цитокининов, вызывающих образование опухолей в растениях Проф. А.К.Гапоненко 20

21 Общая схема генетической карты Ti плазмиды (Tumor inducing) вызывающей опухоли. T- DNA, transferred переносимая ДНК Размеры Т-ДНК Ti и Ri плазмид варьируют от 10 до 30 kbp ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены Проф. А.К.Гапоненко 21

22 Как встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. 1. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli. 2. E. сoli содержит плазмиду pbr322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pbr322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. 3. Бактерии, содержащие плазмиду pbr322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. 4. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. Tumefaciens. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном.

23 Схема трансформационной кассеты СОДЕРЖИТ: 1.Ген интереса Кодирующая последовательность и ее контролирующие элементы 2. Селективный ген - маркер для отличия трансформированное/ нетрансформированное растение 3. Инсерционные последовательности агробактерии (25 пар нуклеотидов с каждого конца) Agrobacterium insertion Проф. А.К.Гапоненко 23

24 В процессе генетической трансформации растительной клетки можно выделить десять главных событий: Источник: Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky, Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology, CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY 2006, 17: Процесс начинается с распознания агробактерией специфических рецепторов клетки хозяина и прикрепления бактерии к клетке хозяина (растения-реципиента), посредством белков, кодируемых хромосомой агробактерии; 2. Опознавание специфических сигналов растительной клетки двух компонентной системой агробактерии (VirA VirG) сигнально трансдукцион ного механизма; 3. Далее следует VirG-mediated сигнальная трансдукция и активация вирулентных (vir) генов в vir области агробактерии; 4. Образование мобильной копии T-DNA, the T-strand; 5. Доставка VirD2 DNA комплекса (незрелый T-комплекс), вместе с несколькими другими Vir белками, в цитоплазму клетки растения реципиента; 6. После ассоциации VirE2 с T-strand, и образования зрелого T-комплекса, последний импортируется через цитоплазму хозяина; 7. T-комплекс активно импортируется вовнутрь ядра клетки растенияхозяина; 8.Оказавшись внутри ядра, the T-DNA доставляется в место интеграции геномной ДНК; 9. T-DNA освобождается от эскортирующих ее белков. 10. Наступает момент интеграция T-DNA в геном клетки хозяина посредством VirD2 и/или VirE2 и факторов хозяина. Проф. А.К.Гапоненко 24

25 Типы агробактериальных векторов для генетической трансформации растений Коинтегративный вектор Бинарный вектор Бинарные векторные системы, создание которых Отсутствуют заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только virобласть, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны Гены vir вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. 25

26 Бинарные векторы CAMBIA Маркерный ген Селективный ген Селективный ген Обязательными элементами бинарного вектора являются: Сайт инициации репликации широкого круга хозяев, либо два репликатора, функционирующих в E. Coli и A.tumafaciens; Правую и левую фланкирующую последовательность Т-ДНК; Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания/инсерции гена (генов) между границами Т-ДНК; Ген, обеспечивающий селекцию трансформантов бактерий, содержащих данный вектор; Целевую кодирующую последовательность, для переноса в растения. Проф. А.К.Гапоненко 26

27 Маркерные гены, для отслеживания процессов трансформации и экспрессии в трансгенных клетках, тканях и растениях Проф. А.К.Гапоненко 27

28 Маркерные гены: ген люцефиразы luc Проф. А.К.Гапоненко 28

29 Маркерные гены β-глюкоронидаза - uida A B Мониторинг транзиентной экспрессии гена β-глюкоронидазы uida, при биобаллистической трансформации подсолнечника: A незрелых зародышах, B семядолях подсолнечника. (Гапоненко, 1993 ) Проф. А.К.Гапоненко 29

30 Маркерные гены β-глюкоронидаза - uida Мониторинг стабильной экспрессии гена β-глюкоронидазы uida при агробактериальной трансформации подсолнечника (Гапоненко, 1993 ) Проф. А.К.Гапоненко 30

31 Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uida в трансгенном подсолнечнике: A разрез незрелого соцветия; B цветках и развивающихся семенах; C прорастающих семенах T 1 (2ой генерации) и D различных тканях растения. A B D C (Гапоненко, 1997 ) Проф. А.К.Гапоненко 31

32 Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uida в трансгенном подсолнечнике: A разрез незрелого соцветия; B специфическая экспрессия гена uida в пыльцевых нитях. A B (Гапоненко, 1997) Проф. А.К.Гапоненко 32

33 Маркерные гены: Green Fluorescent Protein - GFP Мониторинг транзиентной экспрессии гена gfp в незрелых зародышах и каллусных тканях пшеницы после биобаллистики а б в г (а) Транзиентная экспрессия гена gfp в незрелом зародыше пшеницы (б, в) Транзиентная экспрессия гена gfp в каллусных тканях через 24 часа после биобаллистической трансформации; (г) контроль не трансформированный каллус (Фадеев, Гапоненко, 2006) Проф. А.К.Гапоненко 33

34 Оценка стабильной экспрессии гена gfp Стабильная экспрессия gfp гена в трансгенных тканях пшеницы а б в (а) Эмбриогенный каллус. Экспрессия GFP, наблюдаемая на 21 день после трансформации. б) Побег трансгенной пшеницы. 35 дней после трансформации. в) Корешок трансгенной пшеницы. 35 дней после трансформации Экспрессия маркерного гена gfp, обнаруживаемая на 17 день после биобаллистической трансформации, определяется как стабильная (Фадеев, Гапоненко, 2006) Проф. А.К.Гапоненко 34

35 Типы селекции (отбора) трансформированных клеток растений Позитивная придает преимущество в росте трансформированных клеток ПРИ ПОЗИТИВНОЙ СЕЛЕКЦИИ, трансформированные клетки получают возможность расти с использованием специального источника сахаров, азота или регуляторов роста, как агента селекции. Негативная селекция препятствуют росту трансформированных клеток ПРИ НЕГАТИВНОЙ СЕЛЕКЦИИ, более традиционной, в среду для культивирования клеток добавляют токсичные или тормозящие развитие соединения - антибиотики или гербициды, которые используются для уничтожения или предотвращения роста нетрансформированных клеток. При позитивной селекции селективные гены способствуют росту трансформированных тканей, а при негативной селекции селективные гены ведут к смерти или торможение роста нетрансформированных клеток и тканей. Проф. А.К.Гапоненко 35

36 Гены кодирующие токсичные антибиотики для негативной селекции Проф. А.К.Гапоненко 36

37 Вещества и ферменты для углеводород зависимой позитивной селекции Проф. А.К.Гапоненко 37

38 Токсичные гербициды, гены их кодирующие для условно-позитивной селекции Проф. А.К.Гапоненко 38

39 Генетическая трансформация злаков via Agrobacterium tumefaciens ИСТОЧНИК: Plant Biotechnology Journal (2006), 4, pp Ashok Kumar Shrawat and Horst Lцrz Agrobacterium-mediated transformation of cereals: a promising approach crossing barriers Проф. А.К.Гапоненко 39 39

40 Трансформация пшеницы via Agrobacterium с селекцией на глифосате Agrobacterium-mediated large-scale transformation of wheat (Triticum aestivum L.) using glyphosate selection, Plant Cell Rep (2003) 21: , T. Hu, S. Metz, C. Chay, H. P. Zhou, N. Biest G, Chen, M. Cheng, X. Feng, M. Radionenko, F. Lu, J. Fry a Four-day precultured immature embryo b Agrobacterium infection, c embryogenic callus after 1 week mm glyphosate selection medium, d shoot differentiation C+0.1 mm glyphosate e plantlet regeneration mm glyphosate f T0 transgenic plant (left) and non-transgenic control (right) 7 days after being sprayed with Roundup Ultra; this kind of transgenic event (left) with some vegetative damage will not be advanced to the next generation Проф. А.К.Гапоненко 40

41 Что еще необходимо нам рассмотреть по теме: 1.Компетентные к регенерации в растения клетки или ткани 2.Другие способы доставки генов в клетки, компетентные к регенерации в растения 3.Векторные конструкции для доставки генов, представляющих интерес 4. Селективные и маркерные гены 5. Способы регуляции экспрессии целевого гена в нужном месте и в нужное время. 6.Возможность «выключать» собственные гены растения и/или патогенного организма, насекомого вредителя. 7.Стабильность интеграции и наследования введенных генов Проф. А.К.Гапоненко 41 41

42 ДЛЯ УСПЕШНОГО ПРОИЗВОДСТВА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ НЕОБХОДИМА ТРЕХКОМПОНЕНТАЯ СИСТЕМА: ИНТЕГРАЦИЯ СИСТЕМЫ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, СИСТЕМА ДОСТАВКИ ДНК, И ВЕКТОРА, НЕСУЩЕГО ГЕН ИНТЕРЕСА Проф. А.К.Гапоненко 42 42

43 Схематическое представление физических и биологических методов, используемых для переноса генов в растения Проф. А.К.Гапоненко 43 43

44 Практические методы генетической трансформации растений Посредством Agrobacterium tumefaciens Прямой ввод генов методом биобаллистики Методы микроинъекций, электропорации протопластов не имеют практического значения, кроме как для нескольких генотипов риса. Проф. А.К.Гапоненко 44 44

45 Требования к системам генетической трансформации (СГТ) Трансформационное событие сопровождается рядом негативных для селекционера процессов: Инсерционным мутагенезом, вследствие случайности сайта интеграции ДНК Феноменом «умолкания генов» (gene silencing phenomenon) Трансгенные растения показывают различную степень экспрессии трансгенов вследствие эффекта положения, количества встроенных копий и etc. Правила биобезопастености, принятые в Евросоюзе не рекомендуют использовать гены устойчивости к антибиотикам в качестве селективных Необходима позитивная селекция на основе гена фосфоманозаизомеразы (PMI) или гербицид устойчивости bar или: Необходимо использование «Систем удаления селективного гена посредством индукции рекомбинации» Для получения достаточной выборки трансгенных растений, фенотипические не отличающихся от исходных (только по вводимому гену) СГТ должна обладать: Высокой эффективностью; Воспроизводимостью; Для уменьшения риска сомаклональной изменчивости уменьшением фазы культуры in vitro Проф. А.К.Гапоненко 45

46 Разработка «генной пушки» под руководством Джона Сандфорда и Теодора Клейна в Корнельском Университете, США ( ) Джон Сандфорд Klein T.M. 2006, Wien Права на технологию были проданы Du Pont в 1990 г. Source: [(2000) In Vitro, Cell Dev Biol Plant 36: ; Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987), J Part Sci Technol 5:27 37] Проф. А.К.Гапоненко 46

47 Методы генетической трансформации растений Генетическая трансформация растительных клеток путем Биологической баллистики (Biolistic) Принципиальная схема Источник давления «Макроноситель» Металлические частицы с ДНК Клетки растений Проф. А.К.Гапоненко 47

48 Генетическая трансформация растительных клеток путем Биологической баллистики (Biolistic) Баллистической способ генетической трансформации, связанный с преципитацией ДНК на микроскопические частицы и последующим обстрелом этими частицами клеток живой ткани, были впервые применены на растениях в 1987, в 1990 году первые фертильные растения трансгенной кукурузы были получены с помощью этого метода. Эта демонстрация была важным поворотным пунктом в области генной модификации зерновых культур, как и демонстрация в 1983 году способности трансформировать растения Agrobacterium tumefaciens Klein T.M., Wolf E.D, Wu R. and Sanford J.C. (1987) High-velocity microprojec-tiles for delivering nucleic-acids into living cells. Nature 327, Gordonkamm W.J., Spencer T.M., Mangano M.L., Adams T.R., Daines R.J., Start W.G. Obrien J.V., Chambers S.A., Adams W. R., Willetts N.G., Rice T.B., Mackey C.J., Krueger R W., Kausch A.P. And Lemaux, P. G. (1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2, Проф. А.К.Гапоненко 48

49 Общая схема установки PDS 1000 SYSTEM Bio Rad Проф. А.К.Гапоненко 49

50 PDS 1000 He SYSTEM Bio Rad Проф. А.К.Гапоненко 50

51 Прибор компании Bio Rad для генетической трансформации клеток растений in vivo методом биологической баллистики Проф. А.К.Гапоненко 51

52 Установка для биобаллистики др. Кристофера Сауттера, Цюрих, Федеральный Институт Технологии, 1991 год. Проф. А.К.Гапоненко 52

53 История баллистической трансформации растений Доктор Кристофера Сауттер, Цюрих, Федеральный Институт Технологии, 1991 год. Проф. А.К.Гапоненко 53

54 Генная пушка PIG (Particle Inflow Gun), конструкции Д.Файнера и др. Проф. А.К.Гапоненко 54

55 Сотрудники лаборатории проф. Д.Файнера (1993 г.) Вустер, Огайо, США L-R Back: John Finer, Tai-Sheng Cheng, Masood Hadi, Hong-Chang Ma Front: Cheri Nemes, Alex Gaponenko, Philippe Vain, Barb Norris Проф. А.К.Гапоненко 55

56 Методы генетической трансформации растений Д.б.н., А.К.Гапоненко 56 56

57 PIG в секторе клеточной инженерии растений института биологии развития им.н.к.кольцова РАН Проф. А.К.Гапоненко 57

58 Основные этапы генетической трансформации и получения генетически модифицированного (генно-инженерного или биотехнологического) растения 1. Индукция морфогенного каллуса или прямой регенерации клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro. 2. Создание векторных конструкций для доставки и регуляции экспрессии генов «интереса» в клетку-мишень, компетентную к регенерации в растение. 3. Встраивание чужеродных генов в геном реципиента посредством агробактериальной трансформации или прямого ввода генов via биобаллистики. 4. Селективный отбор трансформированных клеток. Введение наряду с геном «интереса» селективного гена для негативной - (устойчивость к антибиотикам гены hyg, nptii) или позитивной селекции (способность усваивать продукт ген PMI фосфоманозаизомераза). 5. Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro. 6. Укоренение или прививка побегов. 7. Адаптация пробирочных растений к условиям теплицы. 8. Молекулярный ПСР и саузерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена. 9. Отбор трансформантов с высокой экспрессией трансгена и с наименьшими отклонениями от исходного фенотипа. 10. UPOF полевые испытания и испытания на биобезопасность. Проф. А.К.Гапоненко 58

59 Agrobacterium Mediated transformation Microprojectile Bombardment (Biolistic) Индукция морфогенного каллуса, выбор экспланта или клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro. Bombardment Селективный отбор трансформированных клеток, на среде с селективным агентом Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro. Укоренение или прививка побегов Молекулярный ПСР, RT-PCR и Cаузерн, Вестерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена. Control plants Transgenic lines Transgenic lines Control plants Адаптация пробирочных растений к условиям теплицы. Отбор трансформантов с высокой экспрессией трансгена и с наименьшими отклонениями от исходного фенотипа. Prof. Alex Gaponenko Полевые испытания и испытания на биобезопасность UPOF. 59

60 Нами исследованы параметры баллистической трансформации, влияющие на эффективность трансформации Физические параметры Физические и химические свойства металлических частиц используемых для переноса ДНК (размер, хим. инертность) Природа ДНК (концентрация, размер молекул), преципитация ДНК на частицы Давление и обьем Не при выстреле Величина отрицательного давления вакуума в камере Расстояние от источника частиц до ткани-мишени Количество выстрелов на один образец ткани Биологические параметры Выбор типа и возраста экспланта Обработка ткани-мишени осмотическим шоком до и после бомбардмента Стратегия селекции трансгенных тканей Отложенная Градационная Регенерационная Проф. А.К.Гапоненко 60

61 Вектор для биобаллистической трансформации злаков с GFP (маркерный) и BAR (селективный) генами под контролем злаковых промоторов ( P.Quail and B.V.Conger 2001) Селективный ген Маркерный ген Плазмида любезно предоставлена нам Prof. P.Conger & Prof. B.Quial Проф. А.К.Гапоненко 61

62 Векторные конструкции, созданные на основе вектора psgfpbar, с Gly I and GST генами, которые любезно предоставлены проф. S. K.Sopory (ICGEB, New-Delhi). Целевой ген GST Целевой ген Проф. А.К.Гапоненко 62

63 Общая схема ведения культуры клеток пшеницы и регенерации растений in vitro Незрелый зародыш, 1-1,5 мм Морфогенный каллус (МК) Неморфогенный каллус (НМК) Морфогенный каллус (МК) Регенерация побегов Регенерация растений 63 (А.К. Гапоненко, и др., 1984) 63

64 Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы Описание эксперимента: Оцениваемые сорта: Лада, Эстер, Мис Баллистическая пушка PIG Сравниваемые параметры: давление гелия 5, 6, 7 и 8 атм расстояние 10, 12, 14 см Срок с момента индукции культуры 4, 7, 10, 14 сутки Морфогенетические каллусы, подготовленные к трансформации Транзиентная экспрессия гена uida через 2 дня после трансформации В эксперименте оценено ~20000 эксплантов Оценка эффективности параметров: Способом оценки эффективности доставки вектора экспрессии, содержащего гены интереса с регуляторными элементами, является сравнение количества участков экспрессии маркерного гена uida на единицу поверхности тканимишени, при различных вариантах опыта (Фадеев, Гапоненко, 2006) Проф. А.К.Гапоненко 64 64

65 Анализ трансгенных растений с помощью олимеразной Цепной Реакции на наличие гена bar Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы (праймер для гена bar) 1, 20 MWMarker1 kb 2 негативный контроль ДНК пшеницы 3 17 ДНК первичных трансформантов 18 позитивной контроль ДНК трансгенного картофеля 19 плазмида pgfpbar Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы (праймер для nos 3 терминатора) (Фадеев, Гапоненко, 2006) 1, 20 MWMarker1 kb 2 негативный контроль ДНК пшеницы 3 17 ДНК первичных трансформантов 18 позитивной контроль ДНК трансгенного картофеля 19 плазмида pgfpbar Проф. А.К.Гапоненко 65

66 Сравнение свойств агробактериальной и биобаллистическая трансформации Агробактериальная трансформация Биобаллистическая трансформация Плюсы Минусы Плюсы Минусы Относительная дешевизна и изученность метода Более предсказуемые результаты внедрения трансгена в геном реципиента Вид и генотип зависимость - трудность применения для многих видов и генотипов Ограничения по количеству вводимых генов Пригодна для любых объектов in vitro (хвойные, злаки, бобовые). Универсальная доставка ДНК в любую ткань и орган. Возможно использовать при прямой регенерации растений, минуя каллус. Позволяет вводить одновременно несколько генов. Не нуждается в сложных векторах. Используется для трансформации пластид Относительная дороговизна метода Непредсказуемость интеграции и копийности вводимых генов Проф. А.К.Гапоненко 66

67 Благодарю за внимание

docplayer.ru

Глава 1

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Генетическая инженерия - это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Суть генетической инженерии сводится к переносу в растения чужеродных генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства [1, 4, 6]. Такие манипуляции осуществляются с помощью соответствующих ферментов - рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющих молекулы ДНК в строго определенных участках, и лигаз, сшивающих фрагменты в единую рекомбинантную молекулу ДНК.

Итак, процедуры генетической инженерии сводятся к тому, что из набора фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирают гибридную структуру, которую затем вводят в клетку. Введенная генетическая информация экспрессируется, что приводит к синтезу нового продукта. Таким образом, вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить измененный организм.

Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных (способных завязывать семена) растений. Это свойство (тотипотентность) открывает для молекулярных биологов большие возможности в изучении функционирования генов, введенных в растения, а также используется в селекции растений. Для конструирования растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, разработать методы, обеспечивающие включение его в наследственный аппарат растительной клетки, регенерировать из единичных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Таким образом, методология генетической инженерии в отношении растений направлена на коренное изменение методов традиционной селекции, с тем чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем прямого введения в них соответствующих генов вместо длительной работы по скрещиваниям.

Формальной датой рождения генетической инженерии растений является полученное с помощью Ti-плазмидного вектора первое в мире химерное растение санбин (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower + been). Это было первым ощутимым, хотя, быть может, и несовершенным свидетельством того, что в отношении растений генетическая инженерия сможет оправдать надежды специалистов в области молекулярной генетики, биологии и селекции.

КОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ РАСТЕНИЙ

В группе почвенных бактерий, известных под общим названием Agrobacteria, есть несколько видов, которые могут заражать растения и вызывать образование опухолей, называемых корончатыми галлами, состоящими из недифференцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения. Клетки корончатых галлов во многих отношениях напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность к неограниченному, нерегулируемому росту. Когда клетки корончатых галлов культивируют in vitro, они растут при отсутствии специальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохранять эти свойства (трансформированный фенотип), даже если убить бактерии антибиотиками. Изучение индуктора опухолей Agrobacterium tumefaciens показало, что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является Ti-плазмида, которая частично интегрируется в хромосомы растений.

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ: Ti-ПЛАЗМИДЫ

В A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA), которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации [2]. Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Все полученные мутации Ti-плазмид разделяют на три основных класса. Мутанты первого класса не индуцируют синтез опинов, но вызывают образование корончатых галлов. Мутанты второго класса утрачивают способность индуцировать развитие опухолей. Мутанты третьего класса стимулируют аномальную дифференцировку нормальных клеток, например избыточный рост корней или побегов. Эти генетические исследования показали, что ДНК Ti-плазмид содержит гены, которые контролируют развитие опухолей, синтез опинов [1-4]. Поскольку у растений с мутантными Ti-плазмидами второго и третьего классов с помощью фитогормонов можно стимулировать опухолеобразование, было предположено, что полученные мутации затрагивают гормональный метаболизм [2, 4, 5].

КАКИЕ ГЕНЫ ЛОКАЛИЗОВАНЫ В Т-ДНК

В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая переводит триптофан в индолилацетамид. Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализирует ранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток [1, 2, 4, 5]. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лактата, который является продуктом превращения ауксина. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК.

Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG. Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин - больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин [4].

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения [4]. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода.

ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены [2, 3].

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход (рис. 4) [1]. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli. E. сoli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмид Т-ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti-плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными методами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цель работы, состоявшая во введении данного гена в геном растения, будет достигнута [1, 3]. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений [3].

В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна: 1) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт достигается с помощью транспозонного мутагенеза (транспозон - последовательность ДНК, способная перемещаться по геному). В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, которые приводят к опухолеобразованию (iaaM, iaaH, ipt), что не отражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Tn5, Tn7). При этом снимается блок с процессов регенерации. При модификации Ti-плазмиды необходимо предусмотреть также наличие уникальных сайтов рестрикции, в которые будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК. Такие уникальные сайты рестрикции создаются включением в искусственные Ti-конструкции последовательностей, которые содержат множественные сайты разрезания для рестриктаз EcoR1, Hind III, Bamh2 и др. В некоторых случаях в одном множественном сайте имеется 18-20 сайтов, узнаваемых разными рестриктазами, почему эти участки и называются полилинкерами [3].

Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть предусмотрено наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор (участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, активность которых индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтез запасных белков, например зеина, который обнаружен только в тканях семян злаков. Наиболее популярным является промотор гена вируса мозаики цветной капусты (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях [2, 3].

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB - это гены, выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в основную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популярностью другой репортерный ген - pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria. Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т-ДНК заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Создан даже специальный прибор - "Shotgun", который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ti-ПЛАЗМИД

Еще несколько лет назад ученые задавали вопрос, можно ли создать сорта, сбалансированные по составу аминокислот, устойчивые к холоду, засухе, не поражаемые вредителями. Сегодня можно с уверенностью утверждать, что такие трансгенные растения уже вышли в поле [6]. По литературным данным, к 1997 году в 30 странах мира проведено более 3 тыс. полевых испытаний. В этих экспериментах использовали трансгенные растения 40 различных видов, относящихся к разным семействам, включая злаки [6]. После успешных экспериментов появились опасения о возможном вреде генетической инженерии для природы и человечества. Однако уже более чем за четверть века своего существования генетическая инженерия не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Главное, в любых экспериментах по генной инженерии следует соблюдать разработанные правила.

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. В арсенале генной инженерии растений есть много приемов, позволяющих получить трансгенные растения, устойчивые к насекомым. Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами "Monsanto", "Ciba Seeds" и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании еще не закончены [6].

Известно, что растения, так же как и животные, способны вырабатывать иммунитет. Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм. Например, у устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины (соединения, выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген h3O2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180?. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется [3]. Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов [5, 7].

Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.

Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений [4, 5].

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте возможностей использования Ti-плазмиды агробактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. В нашей лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу.

Областей применения трансгенных растений так много, что все имеющиеся сведения невозможно изложить в рамках одной статьи. На уровне лабораторных экспериментов ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному содержанию солей и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам (химическим соединениям, которые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаменимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров [6]. Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

Итак, многие надежды уже сейчас превратились в свершения, а агробактерия с ее удивительной Ti-плазмидой в руках ученых стала настоящим инструментом как для познания функционирования растительного генома, так и для решения многих проблем, которые стоят перед сельским хозяйством. К сожалению, в нашей стране трансгенные растения еще остаются на уровне лабораторных экспериментов, поскольку дорога от лаборатории до поля, как и много лет назад, остается непротоптанной, а во многих лабораториях, в том числе и в нашей, уже есть трансгенные растения, которые ждут своего часа.

Литература

1. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. // Рекомбинантные ДНК. М.: Мир, 1986. С. 179-189.

2. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии высших растений. М.: Наука, 1988.

3. Сельскохозяйственная биотехнология: Векторные системы молекулярного клонирования. М.: Агропромиздат, 1991.

4. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений: (Обзор) // Генетика. 1998. Т. 34, № 2. С. 165-182.

5. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский Образовательный Журнал. 1995. № 1. С. 20-27.

6. Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений // Там же. 1998. № 6. С. 3-9.

7. Кулаева О.Н. Этилен в жизни растений // Там же. № 11. С. 78-84.

8. Лещинская И.Б. Генетическая инженерия // Там же. 1996. № 1. С. 32-39.

studfiles.net

Смотрите также

• 
  Растения скетчап
• 
  Растения колосковые
• 
  Метла растение
• 
  Растение опунция
• 
  Ассимиляция растений
• 
  Опунция растение
• 
  Австрия растения
• 
  Плюмерия растение
• 
  Целозия растение
• 
  Растение целозия
• 
  Уникальность растений