10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры. Методы культивирования клеток высших растений

Культивирование клеток высших растений, примеры получаемых продуктов.

Термин «культура клеток, тканей и органов растений» применяется к асептически выращиваемым частям растения: изолированным зародышам, изолированным органам (кончики корней, меристемы побегов, части молодых цветков и плодов), каллусной ткани, суспензионной культуре, культуре протопластов.

Для генетических и физиологических исследований ценным является культивирование одиночных клеток.Для того что бы заставить одиночные  клетки делится разработаны  методы: 1. Метод ткани-«няньки» – кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки».

2. Метод «кормящего слоя» – кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка. 3. Кондиционирование среды путем добавления питательной среды

от интенсивно делящейся культуры клеток.

4. Метод культивирования одиночных клеток в микрокапле, т.е. очень малом объеме (~20 мкл) богатой, оптимально сбалансированной по составу питате среды.

При культивировании in vitro пыльников или микроспор, а также незрелых семяпочек возможно получение гаплоидных растений . Этот феномен связан с переключением развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути развития на другой – спорофитный путь. Процесс образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна называется андрогенез.

гаплоидные растения при андрогенезе могут образовываться из микроспор,из пыльцевого зерна, содержащего вегетативную и генеративную клетки, то возможны 4 пути андрогенеза:

1 Микроспора делится на 2 идентичные дочерние клетки, которые способны к спорофитному развитию. не происходит формирования вегетативных и генеративных клеток.

2 Микроспора в рез-те неравного деления образует вегетативную и генеративную клетки. Спорофиты возникают в результате дальнейшего развития вегетативной клетки, а генеративная клетка дегенерирует.

3 Эмбриоиды формируются только из генеративной клетки. В таких случаях вегетативная клетка  совсем не делится, либо делится до известного предела.

4 в рез-те деления одноядерной микроспоры образуются вегетативная и генеративная клетки, которые в дальнейшем делятся и участвуют в развитии спорофита.

2 метода получения гаплоидных клеток in vitro:

1методы культуры пыльников т.е на питательной среде культивируются изолированные пыльники

2 методы культуры пыльцы соматические ткани пыльника удаляются.

Процесс получения гаплоидных кл методом культуры пыльников:

1.стерилизации бутонов.2. препарирование 3. перенос на среду для

культивирования. Культивирование пыльников проводят на жидких, полужидких и

комбинированных средах.

Формирование эмбриоида из микроспоры длится от 3 до 10 недель.

идентификация. Основными причинами образования негаплоидных растений являются:

 слияние ядер при первых делениях микроспоры;  образование регенерантов из негаплоидных клеток стенки пыльника;  образование регенерантов из негаплоидной пыльцы,  может образовываться у некоторых видов при нормальных условиях с низкой частотой;  мутации в начале эмбриогенного развития.

Гаплоидные растения идентифицируются по морфологическим признакам, а также с помощью цитогенетических методов – подсчета числа хромосом в делящихся клетках кончика корня и т.д.

Методы отделения пыльцы от самотич тк пыльника: 1. Спонтанное освобождение. 2. Гомогенизация и фильтрация.3. разрезание пыльника.

students-library.com

10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры

При этом способе культивирования используются так называемые твердые питательные среды, содержащие гелеобразующий компонент, чаще всего агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат расти­тельного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и кал­лусные клетки находятся на ее поверхности.

Для получения каллусных культур небольшие фрагменты тканей разных органов высших растений помещают на поверхность питатель­ной среды (пробирки, колбы). Через 4-6 недель культивирования экспланта образуется первичный каллус (масса недифференцированных клеток), который необходимо разделить и перенести на свежую пита­тельную среду. Каллусная ткань, выросшая на твердой питательной среде, имеет рыхлую аморфную структуру в виде массы тонкостенных клеток белого или желтоватого цвета. Качественный химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующе­го интактного растения.

Твердофазный способ культивирования чаще используется в лабо­раторных условиях для первичного получения изолированных расти­тельных культур, предварительной оценки культур в качестве возмож­ных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость произ­водить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть.

Высшие растения состоят из множества дифференцированных кле­ток с различными функциями: клетки зеленой ткани листа создают ор­ганические вещества в результате фотосинтеза, клетки корня поглоща­ют из почвы минеральные вещества и подают их в другие части расте­ния и т.д. Но все дифференцированные клетки образовались от одной оплодотворенной яйцеклетки материнского растения - зиготы. Эта клетка содержит в себе всю генетическую основу целого растения. Из нее образуются специализированные ткани, различные по химизму происходящих в них процессов, форме и структуре. Клетка (зигота) яв­ляется родоначальником целого растения, она тотипотентна, т.е. мно­гофункциональна. Кроме зиготы тотипотентность в природных услови­ях могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - веге­тативное размножение черенками, от листа и др. Тотипотентность реа­лизуется также при травмах растений. На раневой поверхности в ре­зультате неорганизованной пролиферации клеток происходит образова­ние нароста - каллуса, способствующего заживлению ран (от лат. callus - мозоль, толстая кожа).

При образовании каллуса в культуре in vitro происходит неоргани­зованный рост клеток и их дедифференциация, т.е. потеря первоначаль­ных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус. Клетки как бы обезличиваются, их функции практически оди­наковы и существуют за счет питательной среды. Однако при измене­нии условий культивирования можно вызвать вторичную дифферен­циацию и получить целое растение. По сравнению с клетками живот­ных и человека растительные клетки обладают большим преимущест­вом. Они способны в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней и почек) из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цито-кининов) и их концентрация в питательной среде.

Как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они твердо «помнят» свое происхождение: клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового — так­же соответствующее растение и т.д. Культивируемые клетки высших растений - это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автоном­ному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может поддерживаться очень долго. Есть ткани, кото­рые поддерживаются в культуре in vitro no 60-70 лет.

Глубинное суспензионное культивирование

Для посева в жидкую питательную среду необходимо получить по­севной материал в виде суспензии клеток. Поэтому первичная каллус-ная ткань, которая используется в качестве посевного материала, долж­на быть более рыхлой и легко фрагментироваться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют через нейлоновые или металлические сита. При пересевах на 100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани.

В лабораторных условиях для культивирования тканей в жидких питательных средах обычно используют колбы емкостью 100-500 мл с небольшим объемом питательной среды. Сосуды с суспензией клеток помещают на качалки с частотой вращения 100—120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточ­ных агрегатов распадается на отдельные фрагменты.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размно­жаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорга­низмов, время их удвоения составляет 1—3 суток. Поэтому даже при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через 2-3 недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость об­новления культуральной среды или пересева культуры на свежую пита­тельную среду.

В промышленных условиях используется метод непрерывного куль­тивирования в ферментерах (биореакторах) различной конструкции,имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением.среды и удалением части суспензии.

Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой для создания систем, позволяющих осуществ­лять непрерывное культивирование.

Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделя­ют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выра­щивания через определенные интервалы времени производится отбор . части суспензии и разбавление оставшейся части суспензии свежей сре­дой. Культивирование в ферментерах такого типа может продолжаться несколько месяцев.

Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непре­рывное снабжение культуральной системы свежей питательной средой с одновременным удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры могут функциониро­вать в течение нескольких лет.

Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом:

-автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, рН среды, степень аэрации, скорость работы ме­шалки и пр.;

-постоянный контроль содержания в культуральной среде ос­новных элементов питания;

-культуральная система периодически пополняется свежей пита­тельной средой;

-постоянно осуществляется микробиологический контроль с це­лью предотвращения инфицирования и гибели культур;

- контроль активности роста и деления клеток;

- контроль образования БАВ.

Необходимо отметить, что для получения БАВ может использовать­ся не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью вы­деляющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает про­цесс их выделения из такого специфического вида сырья.

Культура протопластов

Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточ­ную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение - регене-рант. Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток в ре­зультате слияния протопластов.

Существует два способа разрушения клеточной оболочки - механи-. ческий и ферментативный. Последний менее травматичен для клеток и чаще используется.

Для получения протопластов растительный материал (например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолиро­ванных клеток) обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов. Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении «голых» протопластов также необходимо соблюдать стерильность.

После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов очи­щают от остатков клеток и тканей фильтрованием, смесь ферментов удаляют центрифугированием с последующим промыванием в культу-ральной среде. После очистки протопласты ресуспендируют в пита­тельной (культуральной) среде. Изолированные протопласты широко используются в качестве модельных систем в физиологических, цито­логических, фитопатологических и других экспериментах, а также ген­но-инженерных манипуляциях.

В настоящее время разработаны способы получения новых гибри­дов в результате слияния изолированных протопластов различных рас­тений. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный за­ряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать. Для индук­ции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем. Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться. При слиянии протопла­стов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами.

В результате слияния протопластов возникают два вида новых

клеток:

-гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного ро­дителя;

-гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих

родителей.

Больший интерес представляют гетерокарионы, которые после слияния отбирают микроскопически. Для отбора исходные протопласты окрашивают флуоресцентными красителями различных цветов. Если происходит слияние протопластов мезофилла листа (зеленые) и культу­ры изолированных клеток (бесцветные), то получаются гетерокарионы, состоящие из бесхлорофилльных и хлорофиллосодержащих зон, что позволяет вести отбор без предварительного окрашивания.

В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплаз­мы) формируются новые комбинации генов, которые практически не­возможно получить обычными методами селекции. Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пищевых, декоративных, технических, а также лекарственных растений.

Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля - «то-мофель», гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индей­ского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение.

Микроклональное размножение (культура органов растений)

Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных рас­тений, нашли широкое применение в растениеводстве. Этот метод, на­званный микроклональным размножением, позволяет от одной мери­стемы получить (регенерировать) достаточно большое количество но­вых растений, в том числе и в культуре in vitro.

Обязательным условием для микроклонального размножения явля­ется идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта используют молодые слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие меристематические ткани. Культуры кле­ток, полученные из меристематических тканей, дают возможность по­лучить безвирусные клоны. Распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема, как правило, их лишена.

Восстановление целого растения с помощью изолированных куль­тур может происходить разными путями.

Прямая регенерация - это получение растений «в пробирке» непо­средственно из верхушечных побегов, пазушных почек и т.д.

Косвенная регенерация - получение целых растений из меристема­тических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. В обоих случаях дифференциация и органогенез управляется фитогормонами. Выросшее в пробирке растение переносится в грунт.

Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных кле­ток. Это по сути - клонирование растений. В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десяти­летие, метод микроклонального размножения растений используется уже более 40 лет. Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидеи. Из одно­го безвирусного экспланта ему удалось в течение года получить около 4 млн новых растений, свободных от вирусной инфекции. Метод кло-нального микроразмножения может использоваться для создания элит­ного и суперэлитного посадочного материала.

Основное преимущество метода микроклонального размножения, по сравнению с другими классическими методами, - значительно более высокий коэффициент размножения. Если обычным способом (черен­ками, луковицами, корневищами и т.д.) от одного растения можно по­лучить от 2—3 до 100 растений в год, то методом микроклонального размножения их число можно увеличить от нескольких тысяч до мил­лиона.

К настоящему времени показана возможность клонировать «в про­бирке» около тысячи видов растений. Более чем у ста видов этот метод имеет коммерческое значение. Среди них - декоративные, плодово-ягодные, овощные, древесные, а также некоторые лекарственные рас­тения.

Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выве­дения новых сортов, в том числе и высокопродуктивных лекарственных растений. Для создания нового сорта классическим способом в грунте требовалось 10—30 лет. Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значе­ния не имеет.

studfiles.net

Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений

Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти толь­ко при отсутствии конкуренции с микроорганизмами. Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термо­лабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С.

Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах де­зинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. Не­большие кусочки эксплантанта помещают на поверхность питательной среды с гелеобразующим компонентом. Клетки изолированных расти­тельных тканей могут делиться и давать начало длительно растущей недифференцированной массе, называемой каллусом.

В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по сво­ему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питатель­ных сред обязательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммо­ния), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, суль­фаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих - гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использо­ваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др.

Для успешного роста культур необходимы также источники углеро­да, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неауто-трофны. Лучшим источником углеводного питания является сахароза, используемая обычно в концентрации 2-5%. Реже используется глюко­за или другие сахара.

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов, если все питатель­ные элементы присутствуют в средах. Однако большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах, поэтому до­полнительное внесение витаминов в среду также способствует росту клеток, особенно это относится к витаминам группы В. Чаще исполь­зуют витамины В1 В2, В6, а также кальция пантотенат, биотин, кислоты: аскорбиновую, никотиновую, фолиевую.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть фи-тогормоны. К ним относятся ауксины, регулирующие рост и дифферен-цировку клеток и цитокинины, индуцирующие клеточное деление. Природный ауксин в растении представлен в основном в виде (3-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Для практических целей чаще применяют не ИУК, а синтетические ауксины (а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), фенилук-сусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК) и др.) В отличие от природных ауксинов эти соединения не разрушаются ИУК-оксида-зой в клетках растений.

В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, 6-бензиламинопурин и др. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усиле­нием синтеза ДНК, РНК, белков, а также в дифференцировке клеток. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная ки­слота) или ее натриевая соль, которые улучшают усвоение клетками железа.

На рост и развитие растительных тканей и клеток in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность воздуха. Большинство изолированных культур выращивают­ся в темноте. При необходимости они могут расти и на свету, образовы­вая хлорофилл, но при этом проявляют низкую способность к фотосин­тезу. В некоторых случаях свет может использоваться как фактор, обес­печивающий морфогенез или активизирующий процесс синтеза биоло­гически активных веществ. Для освещения чаще используют люминес­центные лампы с интенсивностью светового потока 1000-1500 люкс. Оптимальная температура для успешного роста большинства куль­тур составляет 25-27 "С; для индукции их морфогенеза требуются более низкие температуры (18-25 °С). Влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70%. Интенсивная аэрация требуется при культивировании клеток в больших объемах с использованием жидких питательных сред. Аэрацию биомассы клеток осуществляют барботированием стерильным воздухом. При выращивании клеток в малых объемах (колбах) аэрация достигается постоянным перемешива­нием суспензий клеток с помощью качалок различной конструкции.

10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры

При этом способе культивирования используются так называемые твердые питательные среды, содержащие гелеобразующий компонент, чаще всего агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат расти­тельного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и кал­лусные клетки находятся на ее поверхности.

Для получения каллусных культур небольшие фрагменты тканей разных органов высших растений помещают на поверхность питатель­ной среды (пробирки, колбы). Через 4-6 недель культивирования экспланта образуется первичный каллус (масса недифференцированных клеток), который необходимо разделить и перенести на свежую пита­тельную среду. Каллусная ткань, выросшая на твердой питательной среде, имеет рыхлую аморфную структуру в виде массы тонкостенных клеток белого или желтоватого цвета. Качественный химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующе­го интактного растения.

Твердофазный способ культивирования чаще используется в лабо­раторных условиях для первичного получения изолированных расти­тельных культур, предварительной оценки культур в качестве возмож­ных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость произ­водить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть.

Высшие растения состоят из множества дифференцированных кле­ток с различными функциями: клетки зеленой ткани листа создают ор­ганические вещества в результате фотосинтеза, клетки корня поглоща­ют из почвы минеральные вещества и подают их в другие части расте­ния и т.д. Но все дифференцированные клетки образовались от одной оплодотворенной яйцеклетки материнского растения - зиготы. Эта клетка содержит в себе всю генетическую основу целого растения. Из нее образуются специализированные ткани, различные по химизму происходящих в них процессов, форме и структуре. Клетка (зигота) яв­ляется родоначальником целого растения, она тотипотентна, т.е. мно­гофункциональна. Кроме зиготы тотипотентность в природных услови­ях могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - веге­тативное размножение черенками, от листа и др. Тотипотентность реа­лизуется также при травмах растений. На раневой поверхности в ре­зультате неорганизованной пролиферации клеток происходит образова­ние нароста - каллуса, способствующего заживлению ран (от лат. callus - мозоль, толстая кожа).

При образовании каллуса в культуре in vitro происходит неоргани­зованный рост клеток и их дедифференциация, т.е. потеря первоначаль­ных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус. Клетки как бы обезличиваются, их функции практически оди­наковы и существуют за счет питательной среды. Однако при измене­нии условий культивирования можно вызвать вторичную дифферен­циацию и получить целое растение. По сравнению с клетками живот­ных и человека растительные клетки обладают большим преимущест­вом. Они способны в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней и почек) из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цито-кининов) и их концентрация в питательной среде.

Как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они твердо «помнят» свое происхождение: клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового — так­же соответствующее растение и т.д. Культивируемые клетки высших растений - это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автоном­ному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может поддерживаться очень долго. Есть ткани, кото­рые поддерживаются в культуре in vitro no 60-70 лет.

Глубинное суспензионное культивирование

Для посева в жидкую питательную среду необходимо получить по­севной материал в виде суспензии клеток. Поэтому первичная каллус-ная ткань, которая используется в качестве посевного материала, долж­на быть более рыхлой и легко фрагментироваться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют через нейлоновые или металлические сита. При пересевах на 100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани.

В лабораторных условиях для культивирования тканей в жидких питательных средах обычно используют колбы емкостью 100-500 мл с небольшим объемом питательной среды. Сосуды с суспензией клеток помещают на качалки с частотой вращения 100—120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточ­ных агрегатов распадается на отдельные фрагменты.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размно­жаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорга­низмов, время их удвоения составляет 1—3 суток. Поэтому даже при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через 2-3 недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость об­новления культуральной среды или пересева культуры на свежую пита­тельную среду.

В промышленных условиях используется метод непрерывного куль­тивирования в ферментерах (биореакторах) различной конструкции,имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением.среды и удалением части суспензии.

Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой для создания систем, позволяющих осуществ­лять непрерывное культивирование.

Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделя­ют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выра­щивания через определенные интервалы времени производится отбор . части суспензии и разбавление оставшейся части суспензии свежей сре­дой. Культивирование в ферментерах такого типа может продолжаться несколько месяцев.

Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непре­рывное снабжение культуральной системы свежей питательной средой с одновременным удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры могут функциониро­вать в течение нескольких лет.

Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом:

-автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, рН среды, степень аэрации, скорость работы ме­шалки и пр.;

-постоянный контроль содержания в культуральной среде ос­новных элементов питания;

-культуральная система периодически пополняется свежей пита­тельной средой;

-постоянно осуществляется микробиологический контроль с це­лью предотвращения инфицирования и гибели культур;

- контроль активности роста и деления клеток;

- контроль образования БАВ.

Необходимо отметить, что для получения БАВ может использовать­ся не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью вы­деляющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает про­цесс их выделения из такого специфического вида сырья.

Культура протопластов

Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточ­ную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение - регене-рант. Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток в ре­зультате слияния протопластов.

Существует два способа разрушения клеточной оболочки - механи-. ческий и ферментативный. Последний менее травматичен для клеток и чаще используется.

Для получения протопластов растительный материал (например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолиро­ванных клеток) обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов. Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении «голых» протопластов также необходимо соблюдать стерильность.

После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов очи­щают от остатков клеток и тканей фильтрованием, смесь ферментов удаляют центрифугированием с последующим промыванием в культу-ральной среде. После очистки протопласты ресуспендируют в пита­тельной (культуральной) среде. Изолированные протопласты широко используются в качестве модельных систем в физиологических, цито­логических, фитопатологических и других экспериментах, а также ген­но-инженерных манипуляциях.

В настоящее время разработаны способы получения новых гибри­дов в результате слияния изолированных протопластов различных рас­тений. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный за­ряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать. Для индук­ции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем. Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться. При слиянии протопла­стов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами.

В результате слияния протопластов возникают два вида новых

клеток:

-гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного ро­дителя;

-гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих

родителей.

Больший интерес представляют гетерокарионы, которые после слияния отбирают микроскопически. Для отбора исходные протопласты окрашивают флуоресцентными красителями различных цветов. Если происходит слияние протопластов мезофилла листа (зеленые) и культу­ры изолированных клеток (бесцветные), то получаются гетерокарионы, состоящие из бесхлорофилльных и хлорофиллосодержащих зон, что позволяет вести отбор без предварительного окрашивания.

В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплаз­мы) формируются новые комбинации генов, которые практически не­возможно получить обычными методами селекции. Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пищевых, декоративных, технических, а также лекарственных растений.

Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля - «то-мофель», гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индей­ского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение.

Микроклональное размножение (культура органов растений)

Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных рас­тений, нашли широкое применение в растениеводстве. Этот метод, на­званный микроклональным размножением, позволяет от одной мери­стемы получить (регенерировать) достаточно большое количество но­вых растений, в том числе и в культуре in vitro.

Обязательным условием для микроклонального размножения явля­ется идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта используют молодые слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие меристематические ткани. Культуры кле­ток, полученные из меристематических тканей, дают возможность по­лучить безвирусные клоны. Распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема, как правило, их лишена.

Восстановление целого растения с помощью изолированных куль­тур может происходить разными путями.

Прямая регенерация - это получение растений «в пробирке» непо­средственно из верхушечных побегов, пазушных почек и т.д.

Косвенная регенерация - получение целых растений из меристема­тических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. В обоих случаях дифференциация и органогенез управляется фитогормонами. Выросшее в пробирке растение переносится в грунт.

Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных кле­ток. Это по сути - клонирование растений. В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десяти­летие, метод микроклонального размножения растений используется уже более 40 лет. Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидеи. Из одно­го безвирусного экспланта ему удалось в течение года получить около 4 млн новых растений, свободных от вирусной инфекции. Метод кло-нального микроразмножения может использоваться для создания элит­ного и суперэлитного посадочного материала.

Основное преимущество метода микроклонального размножения, по сравнению с другими классическими методами, - значительно более высокий коэффициент размножения. Если обычным способом (черен­ками, луковицами, корневищами и т.д.) от одного растения можно по­лучить от 2—3 до 100 растений в год, то методом микроклонального размножения их число можно увеличить от нескольких тысяч до мил­лиона.

К настоящему времени показана возможность клонировать «в про­бирке» около тысячи видов растений. Более чем у ста видов этот метод имеет коммерческое значение. Среди них - декоративные, плодово-ягодные, овощные, древесные, а также некоторые лекарственные рас­тения.

Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выве­дения новых сортов, в том числе и высокопродуктивных лекарственных растений. Для создания нового сорта классическим способом в грунте требовалось 10—30 лет. Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значе­ния не имеет.

Похожие статьи:

poznayka.org

Культивирование клеток растений

План:

Введение………………………………………………………………………3

1. Культивирование клеток растений…………………………………..4
   • Каллюсные структуры
   • Суспензионная культура
   • Культура протопластов.
   • Меристематическая культура.
   • Культура пыльников.
   • Регенерация
2. Клеточная инженерия в нанобиологии. ……………………………10
3. Клеточная инженерия приморского края…………………………..14

Вывод………………………………………………………………………...17

Список литературы………………………………………………………….18

Введение.

Большое значение в биотехнологии приобретают методы, получившие название клеточной инженерии. Предварительно клетки искусственно выделяют из организма и переносят на специально созданные питательные среды, где они в стерильных условиях продолжают жить и размножаться. Такие клеточные культуры (или культура тканей) могут служить для продукции ценных веществ. Например, культура клеток растения женьшень продуцирует лекарственное вещество, как и целое растение.

Клеточные культуры используют и для гибридизации клеток. Применяя  некоторые  специальные  приемы,   можно  объединить клетки разного происхождения организмов, обычная гибридизация которых половым путем невозможна. Метод клеточной инженерии   открывает   принципиально   новый   способ   создания гибридов на основе соединения в единую систему не половых, а соматических клеток. Уже получены гибридные клетки и организмы картофеля и томатов, яблони и вишни и некоторые другие. Открываются огромные перспективы для создания человеком новых форм культурных растений.

У животных получение гибридных клеток также открывает новые перспективы, главным образом для медицины. Например, в культуре получены гибриды между раковыми клетками (обладающими способностью к неограниченному росту) и некоторыми клетками кровилимфоцитами. Последние вырабатывают вещества, обусловливающие иммунитет (невосприимчивость) к инфекционным, в том числе вирусным, заболеваниям. Используя такие гибридные клетки, можно получать ценные лекарственные вещества, повышающие устойчивость организма к инфекциям.

Культивирование клеток растений

Полемика, вызванная успешным клонированием ряда животных, почему-то оставила в тени успехи, связанные с клонированием растений. Ведь уже достаточно давно мы имеем дело либо непосредственно с растениями, разводимыми на основе клонирования, либо с веществами, полученными из культивируемых растительных клеток и тканей. Так, с помощью культивирования меристемы, гарантирующего безвирусность растения, были выведены всюду продаваемые гвоздики, хризантемы, герберы и другие декоративные растения. Также можно купить и цветки экзотических орхидных растений, производство клонов которых уже имеет промышленную основу. Некоторые сорта клубники, малины, цитрусовых выведены с использованием техники клонирования. Прежде для выведения нового сорта требовалось 10-30 лет, теперь же, благодаря применению методов культивирования тканей этот период сокращен до нескольких месяцев. Весьма перспективными признаются работы, связанные с производством на основе культивирования тканей растений лекарственных и технических веществ, которые невозможно получить путем синтеза. Так, уже получают подобным способом из клеточных структур барбариса изохинолиновый алкалоид берберин, а из женьшеня - гинсеносид.

Основу культивирования растительных клеток и тканей составляют содержащаяся в каждой клетке информация о всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ. Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов. Отобранный материал стерилизуется различными веществами. При этом необходимо соблюсти баланс времени, чтобы, с одной стороны, его продолжительность обеспечила уничтожение микроорганизмов, с другой - не повредила бы клетки самой растительной ткани. Подготовка материала к культивированию завершается многократным обмывом стерильной водой, после чего его помещают в стерильную рабочую банку на питательную среду и растят обязательно в стерильных условиях.

Свойство питательной среды определяются поставленными целями культивирования растительного материала, поскольку именно от заданных условий зависит конечный продукт. Питательная среда бывает жидкой или твердой. Она, как правило, состоит из большого числа синтетических веществ с заданной концентрацией. Поскольку изолированные растительные клетки и ткани большей частью являются гетеротрофными, в ней должен содержаться органически связанный углерод, источником которого обычно служат глюкоза или сахароза. Азот добавляется в форме нитратов, используемых клетками с помощью нитратредуктазы. Применяют также фосфор, калий, кальций, магний, сульфаты. Необходимым компонентом являются витамины, в особенности группы В (В1, В2, В6), миоинозит, биотин, а также аминокислоты и органические соли. К безусловно необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, иод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов. Наконец, необходимо наличие в питательной среде ряда фитогормонов. Манипулируя концентрациями различных веществ в питательных средах, кислотностью последних, температурой, освещенностью и влажностью в камерах для культивирования, можно получить растения и вещества с требуемыми свойствами. В зависимости от используемых растительных клеток и тканей, способов культивирования различают следующие основные типы структур: каллюсные, суспензионные, протопластов, меристематические, пыльников.

Каллюсные структуры

Для каллюсных структур исходным материалом является каллюс - это ткань, образующаяся у растений на местах ранений и способствующая их заживлению. Она состоит из более или менее однородных паренхимных клеток, начало которым дает раневая меристема. Элементы каллюса мало дифференцированы, однако вблизи его поверхности наблюдается рост, обусловленный активностью меристематических клеток. Впоследствии в каллюсе возможна дифференцировка его элементов и образование флоэмы, ксилемы и других тканей. Наружные клетки каллюса опробковевают.

Для культивирования на выбранном органе делают надрез, на всей поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. Эта образовавшаяся ткань и культивируется в заданных условиях. В зависимости от вида растения и поставленной цели предварительно необходимо установить состав питательных сред и концентрации фитогормонов, требуемых для оптимального роста. Каллюсы могут выглядеть очень различно. Они бывают рыхлыми или плотными. Окраска каллюса позволяет судить об образовании вторичных веществ. Если каллюс содержать в полной темноте, он беловато-желтый. На свету он образует хлорофилл и становится зеленым. Красный свет указывает на наличие антоциана и бетациана. Чтобы ослабить или устранить эти эффекты, в питательную среду добавляют поливинилпирролидон, глутатион или аскорбиновую кислоту. Коричневые клетки образуются перед отмиранием, поэтому такую ткань необходимо поместить в свежую среду. При длительном культивировании каллюсы могут терять свой морфогенетический потенциал. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцирует и регенерирует, образует осевые побеги, корни и, наконец, все растение целиком, способное к размножению и выращиванию в грунте. Однако большей частью каллюсы используются в качестве исходного материала для клеточного или суспензионного культивирования.

Суспензионная культура

Для суспензионных культур исходным материалом могут быть кака изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллюс. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постояном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит во многих случаях существенно быстрее, чем каллюсной культуры, поскольку скопления клеток поглощают питательные вещества значительно большей общей поверхностью, а у каллюса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которы после их переноса на агар образуют новое растение.

Культура протопластов.

Культуры протопластов получают главным образом из приготовленной из мезофила суспензии, обрабатывая ее ферментами, разрушающими клеточные стенки. В результате этого может произойти присоединение чужих органелл, а также чужой ДНК, которая встраивается в генетический материал ядра, что может выразиться в экспрессивности. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, необходимо нейтрализовать их отталкивание друг от друга, после чего они соединяются. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться и регенерируют новые растения. Во многих случаях удавались слияния протопластов разных родительских растений и последующая регенерация через культуру каллюса нового растения с заданными свойствами. Оказалось возможным скрещивать представителей разных видов и родов, что прежде не удавалось. Слиянием протопластов вырастили, например, гибрид картофеля и томата, "томофель". Этот способ имеет коммерческое значение при выведении новых сортов соевых бобов, цитрусовых, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы и картофеля. Получен также гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше алкалоида тропана в сравнении с родительскими растениями.

Меристематическая культура.

Для меристематической культуры используют меристему - образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, так как они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема их лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве могут регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений и в лесоводстве.

Культура пыльников.

Культура пыльников используется для получения галлоидных растений. Как правило, растение является диплоидным, т.е. в его клетках содержится два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще в стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативное и генеративное зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться. Развивается промежуточный каллюс или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоиды после воздействия колхицина или слияния протопластов. Так образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.

Регенерация

Регенерация - явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференциация управляется фитогормонами, и косвенная, с промежуточной стадией каллюса. В последнем случае возможны также возможны два пути: при органогенезе определенными концентрациями и соотношениями фитогормонов вызывают образование придаточных побегов и корней; при соматическом эмбриогенезе в каллюсе образуются зародыши, из которых вырастает растение, затем переносимое в грунт.

Клеточная инженерия в нанобиологии.

Второе направление развития нанобиотехнологии связано с клеточной инженерией. Культура растительных клеток может служить, прежде всего, источником свойственных данному растению вторичных продуктов. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на специальных средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения безвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм  нужными свойствами. Клетки животных более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят так называемые гибридомы, служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений.

В настоящее время нанобиотехнология становится основой крупного промышленного производства. Исследования по генной инженерии и получению новых материалов все более актуальны. Это, например, относится к применению растениеводческой продукции в качестве биотоплива. Предполагается, что в ближайшем будущем разработки нанобиоиндустрии будут востребованы еще больше.

В связи с ростом населения в мире сельскому хозяйству предстоит не только увеличить продуктивность, но и уменьшить потери урожая в процессе уборки, послеуборочной обработки и хранения. Нанобиотехнология может внести существенный вклад в улучшения питания, сопротивляемости культур неблагоприятным погодным условиям, а также болезням и вредителям.

 Свойства промышленного и сельскохозяйственного сырья на наноразмерном уровне позволят существенно сократить энергоемкость производства единицы продукции, повысить надежность, сроки службы, автоматизировать и внедрить компьютерную технологию в установки и приборы экспресс-контроля и определения качества пищевой продукции, лечения и удлинения продуктивной деятельности биообъектов.

В настоящее время большой интерес представляют так называемые  наноэлектротехнологии, т.е. биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов.

Под термином «наноэлектротехнология» понимаются электрофизические воздействия оптического излучения ультрафиолетового (УФ) диапазона на сельскохозяйственные объекты и их составные элементы на уровне биоклеток и их структур.

 К УФ излучению относится часть оптической области спектра с длинами волн от 11 до 400 нм, которые обладают наибольшей энергетической активностью по сравнению с видимыми и инфракрасным (ИК) излучением. Исследованиями воздействия УФ излучения на организм животных и растений установлено выраженное разностороннее биологическое действие как естественного, так и искусственного излучения.

Фитобиологические реакции независимо от того, в каком объекте они протекают, разделяются на две группы: функционально-физиологические и деструктивно-одифицирующие.

В научных коллективах агропромышленного профиля разработано и обосновано боле 110 энергосберегающих наноэлектротехнологий, в том числе с использованием  электромагнитных полей сверхвысоких частот (ЭМП СВЧ), оптических и ультразвуковых излучений, электрических зарядов и импульсов, элекроаэрозолей и ионов.

Интерес к нанотехнологиям обусловлен тем, что при воздействии на наноуровне материалы и объекты изменяют свою структуру и преобретают некоторые превосходные свойства, включая химические, электрические и оптические. Перспективными направлениями применения нанотехнологий и наноматериалов в сельском хозяйстве могут быть следующие.

Нанороботы (сравнимы по размерам с кровяными клетками или даже меньше их) способны исследовать каждый капилляр. Они поддаются управлению при проведении диагностических операций. Путем применения высокоскоростных беспроводных средств коммуникации нанороботы могут быть объединены в сеть с другими компьютерами, а также образовывать базы данных исследуемых объектов.

Наноустройства, которые могут имплантироваться в растения, животные, позволяют получать и передавать в реальном времени данные о скорости роста и других физиологических характеристиках, обеспечивают определение структуры и продуктивности исследуемых объектов, состояния окружающей среды, а также уровней химических и физических рисков.

Ключевой особенностью биологических наноструктур является способность к распознаванию на молекулярном уровне, которая играет очень важную роль в процессах самосборки атомных и молекулярных структур. Процесс самосборки имеет две характерные особенности: молекулы обладают высокой аффинностью по отношению друг к другу, а в результате образования связей формируется структура с предсказуемыми свойствами. Ученые, которые стремятся создавать определенные наноструктуры, предпочли бы имитировать подобные механизмы сборки. Вместо того чтобы «спускаться» с макроскопического уровня, используя все более точные и дорогостоящие инструменты, удобнее было бы создавать наноконструкции «снизу вверх», начиная с химических систем.

Одно из преимуществ конструирования «снизу вверх» — огромное химическое разнообразие. Поскольку на поверхности компонентов клетки на единицу площади приходится множество функциональных групп, то в качестве строительного блокаможно использовать всю эту сложную в химическом отношении поверхность. В принципе, возможно, менять положение и ориентацию такого блока. Конструирование «сверху вниз», напротив, основано на материалах с небольшим химическим разнообразием. Другое преимущество – значительные количества вещества, с которыми приходится иметь дело на химическом уровне. Всего 1 пмоль вещества содержит 1112 молекул. Компонент, который с наибольшим успехом применяется в экспериментах по имитации  биологической самосборки – ДНК.

Обеспечение населения безопасными продуктами питания при минимальном загрязнении окружающей среды – основа выживания человечества. В этом аспекте роль нанотехнологий в сельском хозяйстве развитых и развивающихся стран, в том числе и Казахстана, вероятно, будет доминирующей.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ PANAX GINSENG C.A.MEY

Флора Приморского края является богатейшим потенциальным источником традиционных и новых лекарственных средств растительного происхождения. По количеству уникальных лекарственных растений, неизвестных, или малоизвестных в нашей стране, но широко используемых за рубежом, Приморский край не имеет себе равных среди других районов России. Однако, как правило, эти растения представлены редкими или исчезающими видами, что не позволяет широко использовать их в медицине.

В полной мере это относится и реликтовому дальневосточному растению - женьшеню настоящему (Panax ginseng C.A.Mey).

Установлено, что биологически активными веществами женьшеня являются гинзенозиды, и главным образом, с этой группой веществ связаны целебные свойства женьшеня (Tanaka and Kasai, 1984). Доказано, что гинзенозиды оказывают сильное иммуностимулирующее, радиопротекторное, противоопухолевое, противовоспалительное, антиязвенное действие. Также эти вещества подавляют развитие тромбов, нормализуют кровяное давление, увеличивают продолжительность жизни нейронов коры головного мозга, положительно действуют на эндокринную систему и углеводный обмен. При применении препаратов женьшеня повышается работоспособность, замедляются процессы старения. Тем не менее, использование женьшеня в медицине ограничено низкими сырьевыми запасами природного растения. Исследованиями последних лет установлено, что генетические ресурсы дикорастущего женьшеня близки к истощению (Zhuravlev et al., 1996).

Недостаток природного сырья можно преодолеть путем введения растительных клеток в культуру in vitro, т.е. в культуру клеток растущих вне организма на специально подобранных питательных средах. Введение в клеточную культуру ценных и редких растений решает одновременно две задачи: во-первых, создается возобновляемый источник сырья для выработки лекарственного препарата, во-вторых, создаются предпосылки для сохранения генофонда растения. Поэтому уже более 30 лет проводятся работы по созданию воспроизводимого биотехнологического источника гинзенозидов путем получения клеточных культур женьшеня, синтезирующих набор гинзенозидов в количествах и соотношениях, близких к нативному растению. В то же время большинство из полученных клеточных культур женьшеня отличаются от натуральных корней тем, что содержат не весь набор гинзенозидов, меньшим содержанием суммы гинзенозидов, соотношениями отдельных гинзенозидов. В настоящее время существует ряд методических приемов, направленных на активацию синтеза биологически активных веществ в культурах in vitro.

В Биолого-почвенном институте ДВО РАН из различных органов растений женьшеня получены клеточные культуры (Журавлев и др. 1990; Булгаков и др., 1991), обладающие способностью к синтезу гинзенозидов. В 1992-1997 гг. нами впервые проведено сравнительное изучение эффективности различных путей регуляции синтеза гинзенозидов в полученных культурах. Увеличения выхода биологически активных веществ женьшеня удалось добиться посредством использования селекции, светового режима культивирования, биосинтетических предшественников гинзенозидов (мевалоновой кислоты и фарнезола) и определенных фитогормонов. Разработана схема комбинированной регуляции синтеза гинзенозидов путем изменения условий культивирования и состава сред в сочетании с методами генетической инженерии. Впервые предпринята работа по получению клеточных культур женьшеня, содержащих чужеродные гены и поиску гена ответственного за увеличение синтеза гинзенозидов. Применение методов генной инженерии позволило получить ряд высокопродуктивных трансгенных корневых культур женьшеня, обладающих способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования, что делает эти культуры новым перспективным источником для выработки биологически активных веществ. Используя генетическую трансформацию геном rolC из Agrobacterium rhizogenes впервые удалось вызвать морфогенез (образование побегов и листьев) в клеточной культуре женьшеня. Установлено, что побеги и листья морфогенной культуры синтезируют гинзенозиды в количествах и соотношениях, свойственных надземной части плантационного растения.

Вывод:

Подводя итог можно сказать, что клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта –изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях. Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

Список литературы:

«Основы биотехнологии» Егорова, Клунова, Живухина; М. 2003.

"Биология" - еженедельное приложение к газете "Первое сентября" (№21 1998)

znakka4estva.ru

Методы создания клеточных культур растений — МегаЛекции

Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на исследовании такого важного свойства растительной клетки, как тотипотентность(свойство клетки реализовывать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма). В экспериментальных условиях при выращивании эксплантов возможна реализация супрессированной (подавленной) в естественных условиях тотипотентности под действием фитогормонов.

Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Основным типом культивируемой растительной клетки

является каллусная.

Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей под действием «раневых гормонов» путем неорганизованной пролиферации дедифферен-цированных клеток при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа.

Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности.

Каллус на травмированной

виноградной лозе

Культура каллусных клеток – это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллуные, т.е. дифференцируются.

Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения (растительные – бактериальной или вирусной этиологии; генетические, возникающие на межвидовых гибридах). Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток. Значительным их физиологическим отличием является гормононеза-висимость, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам. В некоторых случаях они способны образовывать тератомы.

Каллусные клетки способны делиться только при наличии в питательной среде фитогормонов. Однако при длительном культивировании в некоторых случаях они могут утрачивать зависимость от наличия в среде ауксинов и цитокининов. Природа такой независимости к фитогормонам, чаще всего применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они могут утрачивать признак в ряду превращений клетка-растение-клетка. Такие клетки принято называть «привыкшими». В них также как и в опухолевых клетках идет интенсивный синтез собственных гормонов. Часто ткани, образованные «привыкшими» клетками, называют химическими опухолями. Подобно опухолевым, такие ткани не способны к нормальной регенерации и образуют тератомы.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри.

Экспланты

Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Растительные ткани сами по себе могут являться серьезным источником контаминации вследствие присутствия эпифитной микрофлоры. Поэтому до извлечения экспланта часть растения предварительно промывают водой с детергентом, а затем ополаскивают стерильной водой. Затем выделенные экспланты помещают в стерильные растворы, содержащие хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты. После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе их несколько раз промывают стерильной дистиллированной водой и скальпелем стерильно удаляют на срезах несколько слоев клеток.

В некоторых случаях (в основном у тропических и субтропических растений) может встречаться и внутреннее инфицирование тканей. В этом случае принято использовать антибиотики, хотя это и не всегда позволяет получить стерильный эксплант.

Процессу образования каллуса предшествует дедиф-ференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток.

Основным условием превращения растительной клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, готовящие ее к делению, а цитокинины – пролиферацию дедифференцированных клеток. Если эксплант, состоящий из дифференцированых клеток, поместить в питательную среду без гормонов, деление клеток не произойдет, и каллус не образуется. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с возобновлением под влиянием фитогормонов клеточного деления.

В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), ά-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг/л в зависимости от вида экспланта.

Для возбуждения процессов подготовки к делению достаточно начального кратковременного действия ауксина. Поэтому процессы, происходящие в клетках под влиянием ауксина, можно разделить на первичные, непосредственно индуцированные ауксином, и вторичные, являющиеся следствием первичного индуцирующего действия.

В качестве цитокининов применяют зеатин, кинетин и др.

В клетках экспланта, состоящего из неделящихся специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно применять прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение нескольких суток (3-6). Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное неконтролируемое влияние эндогенных гормонов эксплантанта на изучаемые процессы.

Процесс перехода к каллусному росту начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24-48 часов, в течение которых клетки увеличиваются в размерах и ткань экспланта разрыхляется. Далее клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань.

В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают белки, характерные для фотосинтезирующих клеток.

В клетках каллусной ткани происходят не только биохимические, но и цитологические изменения. Через 6-12 часов после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и набухает, увеличивается число свободных рибосом, элементов аппарата Гольджи, а также изменяются число и размеры ядрышек. Все это предшествует началу процессов деления, которые начинаются через 48-72 часа.

Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Однако клеточный цикл у каллусных клеток более длителен.

Их характерной особенностью является выраженная гетерогенность по возрасту в пределах каллусной ткани.

Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными клетками, что свидетельствует о снижение эффекта Пастера.

Клетки каллусной ткани также обладают выраженной генетической гетерогенностью (различаются по числу хромосом, что связано с неорганизованным, несинхронным, анархичным развитием). Встречают диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные клетки, причем, чем длительнее процесс культивирования, тем сильнее различие клеток по плоидности.

В каллусных клетках достаточно часто происходят хромосомные абберации, что сказывается на биологических особенностях клеток.

Одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани является различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, переносится на свежую питательную среду (пассируется или субкультивируется). Размер транспланта (переносимого фрагмента) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно составляет от 60 до 100 мг массы ткани на 30-40 мл питательной среды.

В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенно-стями.

Большинство каллусных клеток могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, поскольку не способны фотосинтезировать. Вместе с тем, свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Для обеспечения протекания данных процессов важны не только интенсивность освещенности, но и качество света. Для достижения оптимизации процесса культивирования часто используют люминесцентные лампы с интенсивностью около 1000 люкс и непрерывным «холодным белым» светом.

Для роста и развития большинства каллусных культур оптимальной является температура 26 °С. Однако индукция процессов морфогенеза требует более низких температур (18-20 °С).

Оптимальная влажность в культуральной лаборатории должна составлять 60-70 %. Большое значение для успешного культивирования каллусных клеток также имеет аэрация.

При культивировании растительных клеток и при выращивании культуры тканей применяются среды Мурасиге-Скуга, Нагата-Такебе, Хеллера, Нича-Нича, Кнудсона и другие в различных модификациях.

Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения).

Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:

megalektsii.ru

Методы культивирования клеток высших организмов

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.

Асептика. культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. М.о, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе/асептических комнатах. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 —2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышенном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С. Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация: часть растения, из кот будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, в сост кот обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие кл деления. Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. При пригот тв пит сред для поверхностного выращивания каллусных тк исп очищенный агар-агар — полисахарид, получ из морских водорослей/ Среда Мурасиге и Скуга пригодна для образования каллусов, поддержания  его неорганизованного роста, индукции морфогенеза у б-ва двудольных растений. Изменение соотн ауксина и кинетина приводит к обр либо корней (преобл ауксина)/стеблевых к-р (преобладание кинетина). Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обесп укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации.

Физические факторы. Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. Аэрация.показано, что синтез 2х метаболитов в суспензионной культуре был наибольшим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии. Влажность. Опт влажность в помещении, где растут культуры, 60 — 70%.

students-library.com

5. Культивирование животных и растительных клеток

Особенности культивирования животных клеток

Животные клетки используются для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона и т.д.

Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с питательной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. В обычной методике культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вокруг своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель – микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки (для сравнения – клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч, а бактериальные клетки – каждые 20-60 мин). Клетки млекопитающих нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в питательную среду следует добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда также должна содержать небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20 % сыворотки (из крови человека или из плода крупного рогатого скота). Для оптимального роста температуру культуры необходимо поддерживать около 37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятся крайне медленно, либо не делятся вовсе; при температуре выше 38 ºС погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при - 180 ºС.

Особенности культивирования растительных клеток

Культивирование растительных клеток в крупных масштабах было освоено в 1976 г. японскими исследователями, которым удалось получить растительную биомассу в объеме 20 м3. Получение массы растительных клеток обходится намного дороже, чем равное количество бактериальных или дрожжевых клеток. Поэтому ученые стараются избежать разрушения клеток с целью извлечения из них полезных для человека соединений. В связи с этим, растительные клетки иммобилизуют внутри пористых полимеров. Доказано, что в таком состоянии клетки удается поддержать жизнеспособными в течение нескольких сотен дней. Проблемой остается извлечение метаболитов в том случае, когда они синтезируются внутри клеток, а не выделяются в среду.

Культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ: алкалоидов и других вторичных метаболитов, фитогормонов (регуляторов роста растений) и т.д.

Использование растительных клеток является перспективным направлением биотехнологии, так как клетки, растущие в культуре, способны синтезировать вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.

Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять общих основных стадий, которые могут различаться в зависимости от целевого продукта и способа его получения. Основные стадии следующие: приготовление питательной среды; получение посевного материала; культивирование микроорганизмов; выделение целевого продукта; очистка целевого продукта. Общая биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза приведена на рис.3.

6. Приготовление питательной среды

Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и других веществ, которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.

Принцип составления питательных сред. Каждый конкретный вид микроорганизмов, используемых в биотехнологии, строго избирателен к питательным веществам. Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется физиологическими особенностями данного вида микроба, но во всех случаях среда должна быть водным раствором этих веществ и обеспечивать в определенном количестве их приток в клетку.

В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизма в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Однако в этом случае не учитываются количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, и то обстоятельство, что состав клеточного вещества микроорганизма зависит от состава среды обитания и варьирует в достаточно широких пределах. Но все же, первоначальную ориентировку в выборе оптимального состава питательной среды, исходя из состава клеточного вещества микроба, сделать можно.

Важнейшим условием приготовления питательных сред является соблюдение правил асептики. Для обеззараживания питательных сред применяют, как известно, химическое воздействие (дезинфекцию), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвука, ультрафиолетовых лучей, ультрафильтрации). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания питательных сред (автоклавирование, стерилизацию, кипячение и др.). Споры микроорганизмов более устойчивы к высокой температуре, поэтому именно споры бактерий являются лимитирующим фактором, определяющим температурные режимы стерилизации сред.

Для стерилизации воздуха в случае аэробных процессов культивирования используют фильтрование и ультрафиолетовое облучение.

Получение посевного материала

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.

Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства. Сначала чистую культуру размножают в лаборатории, затем в цехе чистых культур и инокуляции, далее направляют на культивирование. Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий:

1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.

2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.

3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.

4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.

Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).

Ферментация (культивирование)

Это самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства. Ферментация представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры.

Как говорилось ранее (п.1), для выращивания любой культуры необходимы: жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие ингибиторов роста; соответствующие физико-химические условия.

На оптимальной питательной среде при благоприятных значениях рН и температуры, при условии подачи требуемого количества воздуха в среду микроорганизмы быстро начинают расти и размножаться, обеспечивая накопление биомассы продуцента и биологически ценных метаболитов в культуральной жидкости. Способы ферментации мы рассматривали ранее в разделе 4.

Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании). Для поддержания кислородного режима ферментатор снабжается устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды – мешалками различной конструкции. Для поддержания температуры среды предусмотрены системы охлаждения.

studfiles.net

• 
  Кто скрещивал растения ученый фамилия
• 
  Комнатные растения мужское счастье уход
• 
  Комнатное растение орхидейное дерево фото
• 
  Какие растения не любят гадюки
• 
  Калий для растений где взять
• 
  Как правильно садить хвойные растения
• 
  Как избавиться от растения хмель
• 
  Растения и животные барометры природы
• 
  Растение похожее на лопух фото
• 
  Презентация разнообразие растений для дошкольников
• 
  Презентация на тему соя растение